基于HPTT轴探讨补脾强力复方调节EAMG大鼠免疫系统平衡的机制

王强，况时祥，李若照，娄金波，钱忆家，雍波，刘运权

重症肌无力（myasthenia gravis，MG）是由于乙酰胆碱受体抗体（acetylcholine receptor antibody，AchR-Ab）破坏神经肌肉突触后膜乙酰胆碱受体而诱发的自身免疫性疾病，临床主要表现为患者四肢近端无力、眼睑下垂、复视和吞咽障碍等症状［1-2］。MG病情反复，迁延难愈，多合并甲状腺功能异常等其他自身免疫性疾病，严重者可危及生命。目前临床治疗主要采用大剂量肾上腺皮质激素，但不良反应较大［3］。MG属中医“痿证”范畴，基本病机为脏腑肌肉筋脉损伤。该病起于脾虚，累及于肾，兼有水湿浊毒内生，治疗上应予补脾益肾为主，化湿解毒贯穿始终。补脾强力复方以补中益气汤为基础方，结合临床经验辨证选药，旨在脾肾双补，化瘀祛湿，改善MG症 状［4］。下 丘 脑-垂 体-甲 状 腺-胸 腺（hypothalamus-pituitary-thyroid-thymus，HPTT）轴是神经内分泌系统3个主要轴之一，是MG调节的主要传出通路［5-6］。从HPTT轴调控胸腺自身免疫层面来揭示MG发病机制可能是治疗MG的突破口［7］。本研究拟通过建立实验性自身免疫性重症肌无力（experimental autoimmune myasthenis gravis，EAMG）大鼠模型，探讨补脾强力复方通过HPTT轴调节EAMG大鼠免疫系统的机制。

1 材料与方法

1.1实验材料实验动物：清洁级Lewis雌性大鼠120只，9～10周龄，体质量180～200 g，购自吉林大学实验动物中心，动物生产许可证号：SYXK（吉）2021-0006。主要试剂：补脾强力复方（中药配方颗粒，黄芪6 g，党参6 g，苍术2.2 g，土茯苓4 g，陈皮2 g，升麻2.2 g，丹参3.6 g，淫羊藿1.5 g，锁阳2.2 g，生地4 g，制附片3.5 g）由广东一方制药有限公司生产，贵州中医药大学第二附属医院药房提供；醋酸泼尼松片购自辰欣药业股份有限公司（国药准字H37021900，规格：5 mg）；注射用异戊巴比妥钠购自上海上药新亚药业有限公司（国药准字H31021725，规格：0.1 g），鼠源性AchR-sα亚基97-116肽段序列（R97-116）由西安美联生物技术有限公司合成；CD4、CD25、Foxp3流式抗体购自英国Abcam；苏木素（H9627）、水溶性伊红Y（71014544）购自美国Sigma，大鼠AchR-Ab酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒购自FineTest；血清三碘甲状腺原氨酸（T3）、甲状腺素（T4）、促甲状腺激素（TSH）、促甲状腺激素释放激素（TRH）、肿瘤坏死因子（TNF）-β、白细胞介素（IL）-4和IL-10检测试剂盒购自北京北方生物技术研究所。主要仪器：RM 2016轮转式切片机购自德国Leica公司、BX53型生物显微镜购自奥林巴斯公司、JT-12J电脑生物组织脱水机和包埋机购自武汉俊杰电子有限公司、C2500-R-230V微型高速离心机购自美国Labnet公司、ICV-450电热恒温培养箱购自日本ASONE公司、Multiskan MK3全自动酶标仪购自美国Thermo scientific公司、FC500流式细胞分析仪购自美国Beckman Coulter公司、1260高效液相色谱仪购自美国Agilent公司。

1.2动物分组、造模及给药将120只大鼠按照随机数字表法分为对照组，模型组，补脾强力复方低、中、高剂量组和西药组，每组20只。将大鼠饲养在温度（25±2）℃、湿度50%±10%、光/暗循环12 h的SPF级动物房中，普通颗粒饲料，自由取食和饮水，适应性饲养6周。实验经贵州中医药大学实验动物福利伦理委员会批准。第6周末，复制EAMG实验动物模型［8］，首先将鼠源性R97-116、完全福氏佐剂（CFA）、磷酸盐缓冲液（PBS）按1∶1.5∶1.5体积比充分混匀制成免疫乳剂。取200 μL制备好的免疫乳剂皮下注射至大鼠足垫、腹部、背部等部位，对照组皮下注射等量PBS进行首次免疫。首次免疫后30及45 d，重新制备免疫乳剂（体积比R97-116∶CFA∶PBS=1∶3∶3），再取制备好的免疫乳剂200 μL强化接种，对照组在相同部位注射等量PBS。造模成功2周后进行灌胃治疗，补脾强力复方低、中、高剂量组大鼠分别灌胃4.75、7.12、9.49 g/kg，西药组大鼠灌胃5.4 mg/kg醋酸泼尼松片，灌胃体积为10 mL/kg，模型组和对照组大鼠灌胃等体积生理盐水，1次/d，连续灌胃4周。

1.3对各组大鼠行为学的观察（1）各组大鼠体质量变化。（2）Lennon评分［9］：建模前、建模后和末次给药后对各组大鼠进行Lennon评分。Lennon评分分为4级：0级，大鼠无明显肌无力表现；1级，大鼠撕咬无力，四肢力量减弱，在光滑地面上大鼠前肢打滑，日常活动减少且容易疲劳；2级，大鼠行动明显无力，休息时脊背隆起，脚趾明显弯曲，头尾下垂，动作笨拙，行走不稳；3级，大鼠出现严重无力现象，无撕咬动作，呼吸困难，濒死甚至已死亡。症状居中间者分别评为0.5、1.5、2.5级。

1.4标本采集实验结束时，将每组大鼠均分成2部分，一部分给予0.3%异戊巴比妥钠1 mL麻醉处死，心脏采血，分离血清，-20℃冰箱保存待用；大鼠取胸腺置于预冷生理盐水中洗涤，将胸腺放于KRT缓冲液中洗涤、研磨，并以60目尼龙网过滤，滤液1 200 r/min离心10 min，弃上清液。另一部分大鼠颈椎脱臼处死后立即放入乙醇中浸泡消毒，无菌条件下取出胸腺组织，剥离脂肪、血管和结缔组织，洗涤，去除血细胞，置于盛有PBS培养皿中。采用Follicol法制备胸腺单核细胞悬液，用无菌注射器针芯和200目不锈钢筛网研磨组织获得单细胞悬液。4℃、800 r/min离心10 min，弃上清液，取细胞层，破裂红细胞，PBS液洗2遍，台盼蓝染色液法检测所分离细胞的活力＞90%。

1.5苏木精-伊红（HE）染色评估胸腺组织病理变化常温下梯度乙醇对胸腺组织进行脱水处理，二甲苯透明后的组织块浸蜡、包埋。包埋好的蜡块经切片，脱蜡后放入苏木素染液染色5 min，自来水浸洗返蓝，将切片放入1%水溶性伊红染液中染色5 min，水洗浸洗30 s，风干后中性树胶封片，最后镜检。

1.6ELISA检测血清AchR-Ab含量将实验结束时收集的血样以500×g离心15 min，取上清液，严格按照ELISA试剂盒说明书检测AchR-Ab水平。

1.7胸腺Treg细胞特征性表面标志物及相关细胞因子表达检测取1.4制备的胸腺单核细胞悬液，使用流式细胞分析仪检测EAMG大鼠胸腺中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例。使用TNF-β、IL-4和IL-10 ELISA试剂盒检测大鼠血清Treg细胞相关因子水平，严格按照说明书分别加入各个试剂盒和待测样组分，酶标仪检测光密度值，根据标准曲线计算各样本TNF-β、IL-4和IL-10含量。

1.8HPTT轴功能损伤指标检测采用放射免疫分析法，按试剂盒说明书测定大鼠血清T3、T4、TSH和TRH水平；将大鼠断头取脑，冰盘上剖取皮层，匀浆，采用高效液相层析电化学检验法测定大鼠大脑皮层去甲肾上腺素（NE）含量；取大鼠下丘脑，加入1 mol/L盐酸充分匀浆，采用放射配基分析法测定下丘脑T3受体（T3R）含量。

1.9统计学方法采用SPSS 21.0软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较用单因素方差分析（ANOVA）；组间多重比较时方差齐选用LSD-t法，方差不齐选用Tamhane’s T2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠体质量和行为学变化建模前各组大鼠体质量比较差异无统计学意义（P＞0.05）；建模后，对照组大鼠的体质量大于其余5组（P＜0.05）；给药后，补脾强力复方中、高剂量组和西药组大鼠体质量较模型组升高（P＜0.05），见表1。建模前各组大鼠Lennon评分均为0分；建模后，各建模组大鼠Lennon评分较对照组升高（P＜0.05）；给药后，补脾强力复方低、中、高剂量组和西药组Lennon评分较模型组均降低，且高剂量组和西药组Lennon评分较低、中剂量组降低（P＜0.05），见表2。

Tab.1 Changes of body mass of rats in each group表1各组大鼠体质量变化情况（n=20，g，±s）

Tab.1 Changes of body mass of rats in each group表1各组大鼠体质量变化情况（n=20，g，±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与模型组比较，P＜0.05。

组别对照组模型组低剂量组中剂量组高剂量组西药组F建模前190.33±1.73 191.14±2.02 189.69±1.46 190.72±1.47 190.38±1.78 191.34±2.41 2.117建模后278.08±2.63 205.21±5.29a 201.44±3.00a 211.13±6.19a 209.66±5.46a 203.87±2.72a 928.100＊＊给药后303.92±2.49 193.88±2.86a 208.63±3.04a 213.69±4.29ab 227.15±2.94ab 229.40±3.21ab 295.100＊＊

Tab.2 Changes of Lennon scores in each group表2各组大鼠Lennon评分变化（n=20，分，±s）

Tab.2 Changes of Lennon scores in each group表2各组大鼠Lennon评分变化（n=20，分，±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与模型组比较，c与低剂量组比较，d与中剂量组比较，P＜0.05。

组别对照组模型组低剂量组中剂量组高剂量组西药组F建模前0 0 0 0 0 0-建模后0 2.1±0.3a 2.0±0.4a 1.9±0.5a 2.1±0.4a 2.2±0.3a 57.410＊＊给药后0 2.5±0.3a 1.7±0.3ab 1.6±0.3ab 1.1±0.2abcd 1.2±0.2abcd 117.100＊＊

2.2 各组胸腺组织病理变化HE染色结果显示，对照组胸腺细胞排列整齐，无淋巴细胞坏死。模型组皮质区淋巴细胞变性坏死，髓质区胸腺小体消失，细胞数量减少；补脾强力复方低、中、高剂量组及西药组大鼠胸腺皮质区和髓质区细胞数量明显增多，并且补脾强力复方的剂量越高，细胞数量增多越明显。见图1。

Fig.1 Pathological changes of thymus tissues assessed by HE staining(×200)图1 HE染色评估胸腺组织病理变化（×200）

2.3 胸腺Treg细胞特征性表面标记物表达与对照组相比，模型组大鼠胸腺CD4+CD25+、CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例下降（P＜0.05），CD4+CD25-Foxp3+和CD4+CD25+Foxp3-Treg细胞比例升高（P＜0.05）；与模型组相比，补脾强力复方中、高剂量组及西药组大鼠胸腺CD4+CD25+和CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例升高（P＜0.05），CD4+CD25-Foxp3+和CD4+CD25+Foxp3-Treg细胞比例下降（P＜0.05）。见表3。

2.4 各组大鼠血清AchR-Ab和胸腺Treg细胞相关细胞因子含量变化与对照组相比，模型组AchRAb、TNF-β、IL-4和IL-10水平明显升高（P＜0.05）；与模型组相比，补脾强力复方中、高剂量组及西药组AchR-Ab、TNF-β、IL-4和IL-10水平明显降低（P＜0.05），见表4。

2.5 各组大鼠HPTT轴相关指标变化所有大鼠的T3、T4水平差异无统计学意义（P＞0.05）；与对照组相比，模型组的T3R和NE水平下降（P＜0.05），TSH和TRH水平升高（P＜0.05）；与模型组相比，补脾强力复方中、高剂量组及西药组的T3R和NE水平升高（P＜0.05），TSH和TRH水 平 降 低（P＜0.05）。见表5。

Tab.3 Expression levels of characteristic surface markers of thymus Treg cells in each group of rats表3各组大鼠胸腺Treg细胞特征性表面标志物表达（n=10，%，±s）

Tab.3 Expression levels of characteristic surface markers of thymus Treg cells in each group of rats表3各组大鼠胸腺Treg细胞特征性表面标志物表达（n=10，%，±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与模型组比较，c与低剂量组比较，d与中剂量组比较，P＜0.05。

组别对照组模型组低剂量组中剂量组高剂量组西药组F CD4+CD25+70.13±12.42 56.92±10.04a 61.82±11.78 67.99±14.52b 69.95±15.67bc 70.03±13.84bc 13.761＊＊CD4+CD25+Foxp3+75.58±12.64 49.21±6.02a 58.87±12.46a 63.77±13.40ab 71.24±12.78bcd 75.13±15.81bcd 6.857＊＊组别对照组模型组低剂量组中剂量组高剂量组西药组F CD4+Foxp3+98.61±4.69 95.48±3.59 95.91±4.38 96.42±3.25 97.16±4.08 95.27±3.05 1.032 CD4+CD25-Foxp3+27.19±9.63 45.12±4.11a 38.44±3.03a 30.18±4.19bc 29.78±3.46bc 28.09±2.72bc 19.461＊＊CD4+CD25+Foxp3-2.59±0.96 4.18±0.62a 3.52±0.73 3.25±0.69b 2.83±0.57b 2.79±0.80b 6.374＊＊

Tab.4 Comparison of serum levels of AchR-Ab and thymus Treg cell-related factors between the six groups of rats表4各组大鼠血清AchR-Ab和胸腺Treg细胞相关因子含量比较 （n=10，±s）

Tab.4 Comparison of serum levels of AchR-Ab and thymus Treg cell-related factors between the six groups of rats表4各组大鼠血清AchR-Ab和胸腺Treg细胞相关因子含量比较 （n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与模型组比较，c与低剂量组比较，d与中剂量组比较，P＜0.05。

组别对照组模型组低剂量组中剂量组高剂量组西药组F AchR-Ab（pmol/L）0.23±0.05 0.45±0.04a 0.41±0.06a 0.38±0.05ab 0.26±0.08bcd 0.24±0.04bcd 30.516＊＊TNF-β（ng/L）58.26±6.69 89.18±9.59a 77.49±10.04ab 69.42±8.28abc 61.06±7.35bcd 59.56±6.57bcd 22.223＊＊IL-4（ng/L）42.13±9.73 68.83±15.83a 61.93±14.52a 58.24±12.34ab 49.39±11.53b 48.27±10.94b 6.143＊＊IL-10（ng/L）45.23±7.52 72.11±8.02a 68.37±9.46a 61.37±8.47ab 50.14±6.78bcd 48.63±7.41bcd 19.736＊＊

3 讨论

HPTT轴调控胸腺自身免疫是MG发病的关键因素，绝大多数MG患者均伴有胸腺组织功能异常［10］。当切除胸腺后，大鼠MG症状得以有效缓解和改善，提示MG的发生与胸腺异常密切相关［11］。本研究发现，中、高剂量补脾强力复方对EAMG有良好的治疗效果。综合全方，补脾强力复方发挥作用的可能机制为：其一，补脾强力复方具有脾肾双补的功效，MG以脾胃气虚为本，补脾强力复方使先天充养富足，后天生化有源，因而脾胃气虚可得以有效缓解。其二，补脾强力复方具有健脾化湿解毒，邪去正复等作用，用药后气血流畅，湿毒已去。其三，补脾强力复方可以活血化瘀，通调气血，增精益血，有利于肌力恢复。全方共奏使脾肾双补，气血通常，筋肉得养［12-13］。

本研究结果显示，与对照组相比，建模后其他各组大鼠体质量下降，Lennon评分升高，提示建模成功。给药后，中、高剂量组和西药组大鼠体质量较模型组升高，Lennon评分下降，提示经药物治疗后，从中剂量组开始治疗已显效。补脾强力复方低剂量组、中剂量组基本维持给药前的肌无力症状或稍有好转，但较给药前症状变化不明显。补脾强力复方高剂量组与西药组Lennon评分明显降低，肌无力症状均明显好转，提示高剂量补脾强力复方以及激素能够明显改善EAMG大鼠肌无力症状。HE染色结果显示，使用补脾强力复方干预后，小鼠胸腺细胞数量增多，且随着剂量的增加，皮质区和髓质区细胞数量增加更多，呈现剂量依赖性，提示补脾强力复方可改善胸腺组织病理损伤。

MG的病理基础是AchR-Ab导致的神经肌肉神经突触的相应受体破坏，因此降低AchR-Ab水平有助于治疗MG和减缓MG进展［14］。本研究结果显示，补脾强力复方中、高剂量组及西药组AchR-Ab水平明显降低，提示中、高剂量补脾强力复方可减少AchR-Ab表达，进而减少因AchR-Ab导致的受体破坏，恢复神经肌肉功能。本研究显示，与模型组相比，补脾强力复方中、高剂量组及西药组大鼠胸腺CD4+CD25+T、CD4+CD25+Foxp3+T细 胞 比 例 升 高，CD4+CD25-Foxp3+和CD4+CD25+Foxp3-比例下降。Foxp3是目前公认的CD4+CD25+T细胞的特异性标志，其基因水平调控CD4+CD25+T细胞的发育和成熟，FOXP3表达下调引发CD4+CD25+Treg细胞减少，机体免疫耐受被破坏，形成自身免疫损伤［15］。XU等［15］认为Treg细胞比例和数量的减少可能是MG发病的主要原因。本研究结果显示，与模型组相比，补脾强力复方中、高剂量组及西药组TNF-β、IL-4和IL-10水平明显降低，提示高剂量补脾强力复方可能通过调节TNF-β、IL-4和IL-10等细胞因子，对Treg细胞表达比例进行调控。

Tab.5 Effects of Bupi Qiangli compound on functional impairment index of HPTT axis表5补脾强力复方对HPTT轴功能损伤指标的影响 （n=10，±s）

Tab.5 Effects of Bupi Qiangli compound on functional impairment index of HPTT axis表5补脾强力复方对HPTT轴功能损伤指标的影响 （n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与模型组比较，c与低剂量组比较，d与中剂量组比较，P＜0.05。

组别对照组模型组低剂量组中剂量组高剂量组西药组F T3（μg/L）1.92±0.26 1.87±0.19 1.94±0.21 1.88±0.10 1.93±0.25 1.82±0.07 0.551 T4（μg/L）119.41±9.49 112.05±10.43 116.23±10.13 111.89±17.06 110.99±11.55 111.42±16.22 0.698 T3R（fmol/mg DNA）178.51±32.63 125.32±45.29a 131.40±39.96a 155.41±36.19ab 169.57±45.46bcd 173.99±42.72bcd 3.100＊NE（ng/g）793.19±122.96 453.59±102.86a 508.96±113.04a 553.27±104.39ab 687.22±122.34bcd 696.24±123.31bcd 12.774＊＊TSH（μg/L）11.39±1.66 29.94±3.38a 26.61±2.34a 21.65±1.18bc 18.92±1.23abcd 19.82±1.40abcd 102.272＊＊TRH（ng/L）154.61±31.61 289.82±51.59a 227.19±51.42ab 195.26±45.26b 161.86±44.37bc 159.23±35.75bc 14.465＊＊

本研究结果显示，所有大鼠T3、T4水平无明显差异，补脾强力复方中、高剂量组T3R和NE水平较模型组明显升高，TSH和TRH水平明显降低。既往有研究显示，HPTT轴能够通过神经递质及内分泌激素受体来实现免疫调控作用，从而影响所有的免疫功能［17］。下丘脑神经内分泌细胞产生TSH，随血液进入垂体前叶，促进甲状腺激素合成与释放。TSH不仅能够调节甲状腺激素分泌，其在免疫系统中也具备突出的功能和意义，HPTT轴与免疫系统存在复杂而紧密的联系，这其中TSH发挥了重要作用［18-20］。一般而言，TSH在T3和T4变化之前就发生改变，尤其亚临床甲状腺功能异常时仅有TSH水平的变化而不伴有明显的T3和T4水平的改变，因此本研究中EAMG大鼠可能伴随亚临床甲减症状。既往研究表示，MG患者常伴有甲状腺功能异常，可能是甲状腺功能亢进、甲状腺功能低下或亚临床甲状腺功能减退，造成这种现象的原因可能是由于甲状腺自身抗原的免疫交叉反应［21］。有研究发现，MG患者T3R减少，使TRH合成降低，进而影响垂体TSH合成［22］，说明MG患者的HPTT轴功能损伤后造成神经递质和神经肽功能紊乱。

综上所述，补脾强力复方可能通过干预HPTT轴，进而调节大鼠神经内分泌和免疫功能，改善EAMG大鼠自身免疫平衡。