坎离颗粒抑制血管紧张素Ⅱ诱导H9c2心肌细胞肥大的作用机制探究

李 悦，王肖龙，姚成增

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是各种心血管疾病发展的终末阶段，且预后较差[1]。慢性心肌肥大及其相关的心肌重构是CHF发生发展的主要病理基础[2]。血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)作为肾素-血管紧张素-醛固酮系统的主要组成部分，是导致心肌肥大及心肌重构的重要致病因素，而血管紧张素转换酶抑制剂及AngⅡ受体拮抗剂可抑制心肌肥大的发展进程[3]。因此，抑制AngⅡ相关的心肌肥大对改善CHF预后具有重要意义。

中医药防治CHF相关证候历史候久。多项临床研究证实，中医药可改善CHF病人的临床症状，提高CHF病人的生活质量[4]。坎离颗粒是蒋梅先教授在继承全国名老中医张伯臾的学术经验基础上，创制的治疗CHF经验方，经本学科长期应用，疗效显著。临床研究已证实，坎离颗粒对CHF病人的疗效显著，能明显改善CHF病人的肾素-血管紧张素-醛固酮系统指标、内皮功能及心率变异性等，提高心力衰竭病人的活动耐量和生活质量[5-7]。基础研究也已证实，坎离颗粒具有改善心肌一氧化氮(NO)/内皮素(ET)值，抑制心肌细胞凋亡，降低其心肌胶原体积分数、心脏指数、左室质量指数、左心室舒张末期内径，升高Ⅰ/Ⅲ型胶原比值等药理效应[8-9]。本研究运用AngⅡ诱导心肌肥大，探索坎离颗粒抗CHF的作用机制，以期为坎离颗粒在心血管疾病方面的应用提供更有力的证据，为心血管疾病的治疗提供新方向。

1 材料与方法

1.1 材料 实验药物坎离颗粒(生黄芪、熟附子、白术等9味中药组成)由上海中医药大学附属曙光临床医学院制剂室制作而成；H9c2心肌细胞购自上海中国科学院细胞库；AngⅡ(货号：A9525)购自美国Sigma公司；改良伊格尔培养基DMEM(货号：C11995500CP)、胎牛血清(货号：10099141)、胰蛋白酶(货号：25200072)和青霉素/链霉素双抗(货号：15140122)购自美国Gibco公司；BCA蛋白定量试剂盒(货号：NCI3225CH)购自美国Thermo公司；RIPA裂解液(货号：P0013C)购自中国碧云天公司；CellTiter-Glo®发光法细胞活力检测试剂盒(货号：G7571)购自美国Promega公司；TRIzol试剂(货号：15596-026)购自美国Invitrogen 公司；RNA抽提试剂盒Direct-zolTMRNA MiniPrep(货号：A-R2051)购自美国Zymo Research公司；逆转录试剂盒(货号：RR047A)购自日本Takara公司；实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)试剂盒(货号：AM1005)购自美国Thermo公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号：NCI3225CH)购自美国Thermo公司；兔多克隆抗体心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)(货号：NBP2-14873)购自美国Novus公司；兔多克隆抗体脑钠肽(brain natriuretic peptide，BNP)(货号：ab19645)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)(货号：ab38898)、组织金属蛋白酶组织抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1，TIMP-1)(货号：ab38898)均购自美国Abcam公司；兔多克隆抗体基质金属蛋白酶-1(matrix metalloproteinases，MMP-1)(货号：DF6325)购自美国Affinity公司；小鼠单克隆抗体β-肌球蛋白重链(β-myosin heavy chain，β-MHC)(货号：sc-53089)购自美国Santa Cruz公司；PCR引物由上海铂尚生物技术公司合成，引物序列见表1。

表1 基因名称及引物序列(5′-3′)

1.2 方法

1.2.1 H9c2心肌细胞的培养 H9c2心肌细胞系在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的二甲基亚矾(DMEM)培养基中置于5%CO2、37 ℃恒温培养箱中小心培养。待细胞生长密度至80%～90%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代或冻存。

1.2.2 AngⅡ及坎离颗粒溶液的配制 AngⅡ溶于无血清的DMEM培养基中，配制成1 mmol/L母液，根据需要浓度再行稀释。坎离颗粒浸膏粉以二甲基亚砜(DMSO)为溶剂，再溶于无血清DMEM培养基中，配制成1 mg/mL母液，根据需要浓度再行稀释(DMSO浓度不超过0.1%)。

1.2.3 H9c2心肌细胞的分组及处理方法 取对数生长期细胞，胰蛋白酶消化后以适当密度铺于6孔板、26孔板或96孔板，待细胞长至70%左右时进行药物干预。第1部分实验分为4组，空白组：H9c2心肌细胞正常培养24 h，未做任何处理；AngⅡ-24 h组：H9c2心肌细胞加入浓度为100 nmol/L的AngⅡ培养24 h；AngⅡ-48 h组：H9c2心肌细胞加入浓度为100 nmol/L的AngⅡ培养48 h；AngⅡ-72 h组：H9c2心肌细胞加入浓度为100 nmol/L的AngⅡ培养72 h。第2部分实验分为5组，空白组：H9c2心肌细胞正常培养48 h，不做任何处理；AngⅡ组：H9c2心肌细胞加入浓度为100 nmol/L的AngⅡ培养48 h；坎离颗粒低剂量组：H9c2心肌细胞加入浓度为100 nmol/L的AngⅡ+低剂量(25 μg/mL)坎离颗粒溶液培养48 h；坎离颗粒中剂量组：H9c2心肌细胞加入浓度为100 nmol/L的AngⅡ+中剂量(50 μg/mL)坎离颗粒溶液培养48 h；坎离颗粒高剂量组：H9c2心肌细胞加入浓度为100 nmol/L的AngⅡ+高剂量(75 μg/mL)坎离颗粒溶液培养48 h。

1.2.4 α-actin免疫荧光染色 准备4组24孔板，在每块板中间区域轻轻放入6块玻片，每孔先加入1 mL的1×磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗1遍，将生长状态良好的H9c2心肌细胞用胰蛋白酶消化，以密度为1×103左右的细胞密度种到24孔板内。培养24 h后进行相应处理。将处理好的细胞加入4%多聚甲醛室温固定15 min，随后用PBS清洗2遍，每次5 min；加入0.2% TritonX-100通透5 min，随后清洗3遍，每次5 min；室温封闭30 min，随后清洗2遍，每次5 min；加入一抗稀释液，4 ℃过夜处理；次日清洗细胞后，加入二抗稀释液，室温孵育40 min，随后清洗2遍，每次5 min；最后加入DAPI工作液，避光室温处理1 min，随后清洗晾干，封片，使用激光共聚焦显微镜扫描拍照。

1.2.5 实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)检测基因mRNA表达水平 使用TRIzol试剂和Direct-zolTMRNA MiniPrep试剂盒提取细胞内总RNA，随后对提取的RNA进行逆转录。扩增条件：95 ℃ 10 s变性、60 ℃ 20 s退火、72 ℃ 20 s延伸，共42个循环。mRNA相对表达量采用2-△△Ct法测定。

1.2.6 蛋白免疫印迹(Western Blot)检测H9c2心肌细胞中相关蛋白表达水平 使用RIPA裂解缓冲液中裂解实验细胞，并使用BCA蛋白定量分析试剂盒测定蛋白浓度。制备蛋白样本，将等量的煮沸蛋白质提取物通过7.5%或10.0% 聚丙烯酰胺凝胶分离，然后转移到甲醇预活化的聚偏二氟乙烯膜上。将膜与5%脱脂牛奶在室温下孵育1 h，然后与目的一抗稀释液在4 ℃下孵育过夜。然后将膜在二抗中室温孵育2 h。使用增强的化学发光试剂使印迹中的蛋白质可视化。

2 结 果

2.1 AngⅡ诱导H9c2心肌细胞肥大最佳作用时间的确定

2.1.1 不同时间AngⅡ刺激H9c2心肌细胞表面积的变化 细胞免疫荧光实验结果显示，与空白组比较，AngⅡ刺激H9c2心肌细胞24 h、48 h和72 h后，心肌细胞表面积均有一定程度的增大，其中AngⅡ诱导H9c2心肌细胞48 h时，细胞表面积增加最为明显。详见图1。

图1 不同时间AngⅡ刺激对H9c2心肌细胞表面积影响的细胞免疫荧光

2.1.2 不同时间AngⅡ诱导的H9c2心肌细胞肥大基因的蛋白表达变化 与空白组比较，AngⅡ-24 h组、AngⅡ-48 h组、AngⅡ-72 h组ANP、BNP、β-MHC、MMP-1、MMP-9和TIMP-1的蛋白表达均明显上升，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；其中AngⅡ-48 h组上述基因的表达增加最为明显，差异均有统计学意义(P<0.01)。因此，后续实验均采用AngⅡ刺激细胞48 h为心肌肥大模型最佳诱导时间。详见图2。

与空白组比较，＊P<0.05，# P<0.01。

2.1.3 坎离颗粒对H9c2心肌细胞活力的影响 坎离颗粒用药浓度范围经过多组多次由高到低的实验浓度筛选，最终得到相对精确的实验用药浓度。首先分别用0 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、800 μg/mL、1 600 μg/mL坎离颗粒处理H9c2心肌细胞48 h，进行CellTiter-Glo4®检测，结果显示，与 0 μg/mL比较，100 μg/mL时细胞活力开始下降，至400 μg/mL时细胞存活率>50%，800 μg/mL时细胞存活率<50%，由此确定400 μg/mL为低浓度细筛最高值(见图3A)。随后采用浓度为0 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL、250 μg/mL、300 μg/mL、350 μg/mL、400 μg/mL、450 μg/mL坎离颗粒处理H9c2心肌细胞48 h，检测细胞存活率，结果显示，与0 μg/mL比较，至100 μg/mL时细胞存活率>90%，150 μg/mL时细胞存活率<90%，因此确定100 μg/mL为坎离颗粒实验用药浓度上线(见图3B)。因此，后续实验选用25 μg/mL、50 μg/mL、75 μg/mL坎离颗粒作为其高、中、低剂量组。

图3 坎离颗粒的细胞毒性实验

2.2 坎离颗粒对H9c2心肌细胞肥大模型的干预作用 采用qRT-PCR与Western Blot 法检测坎离颗粒干预心肌细胞48 h后的ANP、BNP、β-MHC、MMP-1、MMP-9和TIMP-1 mRNA与蛋白表达水平。与空白组比较，AngⅡ组ANP、BNP、β-MHC、MMP-1、MMP-9和TIMP-1 mRNA与蛋白表达均明显上升，差异均有统计学意义(P<0.01)；与Ang Ⅱ组比较，坎离颗粒用药组ANP、BNP、β-MHC、MMP-1、MMP-9和TIMP-1 mRNA与蛋白表达明显下降，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，提示坎离颗粒能够有效抑制Ang Ⅱ诱导的心肌肥大相关mRNA与蛋白水平的上调。详见图4。

与空白组比较，＊ P<0.01；与AngⅡ组比较，#P<0.05，△ P<0.01。

3 讨 论

CHF作为世界范围内死亡的主要病因之一，发病群体逐渐年轻化，其5年内存活率接近恶性肿瘤[10-12]。CHF具有复杂的病理生理学特征，研究表明包括心肌肥大在内的心肌重构是CHF临床进程的重要决定因素[13-16]。心肌肥大是机体受到生理或病理刺激初期做出的适应性反应，以减少室壁应力并维持心脏功能，随着病程时间的延长，生理性心肌肥大向病理性心肌肥大转变，持续性的肥大则会加重心肌重构，最终导致CHF的发生与发展[17-18]。

目前，现代医学治疗CHF的观念发生了明显变化，为提高病人生活质量，延长生命，CHF治疗目标不再只是追求其暂时的症状改善，更重要的是预防和延缓心肌重构的发生和发展。因此，抑制心肌重构，改善心脏功能，是当前阶段治疗CHF的重要方向[17，19]。临床常用药物ACEI类、β受体阻滞剂、醛固酮拮抗剂及伊伐布雷定、脑啡肽酶抑制剂等均是通过抗心肌重构而抑制CHF的发展[20-21]，虽然CHF病人的长期死亡率明显下降，但这些药物引发的副作用较多，病人的生活质量依然低下，如使用利尿剂后，CHF病人血流动力学虽有明显好转与改善，但可能会出现尿酸升高、肾功能恶化等一系列不良反应，进而导致其他并发症，严重影响病人的生存质量[22]。因此，探索疗效显著且副作用小的治疗方式迫在眉睫。

中医药在治疗CHF方面有丰富的临床经验及独特的理论体系。CHF 属于中医学“心悸”“胸痹”“喘证”“痰饮”“水肿”等范畴，其临床表现主要为心悸、心慌、胸闷、喘咳、咳痰、气短、肢体浮肿等。中医认为心主血脉，其以血为本，以气为用，全身上下血液之运行有赖心气之推动，于百脉中川流不息，以发挥濡养四肢百骸之功能。对心功能的认识，传统医学与现代医学并无歧义。多项科学研究证实，中医药在治疗CHF有着较为完善的治疗体系和较好的临床疗效[23-24]。坎离颗粒是蒋梅先教授在继承全国名老中医张伯臾教授学术思想和临床经验基础上创制的治疗心力衰竭的经验方，经本学科长期临床应用，疗效显著。近30年的临床应用业已证实该方可有效增加CHF病人的活动耐量，提高病人6 min步行距离，改善病人的临床症状等[25]。

本研究借助离体实验的方法，采用AngⅡ刺激H9c2心肌细胞构建心肌肥大模型，对该方的药理机制进行深入探究。H9c2大鼠心肌细胞系来源于胚胎期BD1X大鼠心脏组织的亚克隆细胞系，因其具有培养操作性强、可传代且细胞存活率高等优势，在心血管疾病研究领域有着较为广泛的应用[26-27]。目前，国内外多项基础研究均采用H9c2大鼠胚胎心肌细胞株作为离体实验部分的细胞载体，用以探索某种基因或药物在心肌重构或心力衰竭中的作用机制[28]。此外，AngⅡ是肾素-血管紧张素-醛固酮系统的重要执行因子，参与多种心血管事件的发生发展，在不增加血管阻力和心脏后负荷的情况下，AngⅡ能够直接作用于心肌细胞促进其肥大，使胞内肥大基因ANP、BNP和β-MHC的表达增加[29-32]。ANP、BNP等利钠肽的血浆水平已被证明是心力衰竭等心血管疾病诊断和预后的生物标志物，两者的血浆水平变化可反映左室收缩和舒张功能障碍、瓣膜功能障碍以及右室功能障碍等情况[33-34]。而心肌细胞作为一种高度分化的终末细胞，以α-肌球蛋白为主，当心肌肥大时，收缩蛋白以β-MHC 占优势。β-MHC与心肌重构密切相关，其蛋白水平升高一定程度上可以反映心肌重构程度[35]。此外，基质金属蛋白酶(MMPs)家族在CHF进程中同样有重要作用，金属蛋白酶抑制因子(TIMPs)是MMPs的内源性抑制物，也被证实参与心肌重构的病理过程，在衰竭的心脏组织中，MMP/TIMP 失衡可促进纤维胶原的逐渐降解，从而导致心室壁变薄和心室扩张，两者失衡加速了心肌重构和CHF的发展[36-37]。

本研究结果显示，AngⅡ刺激后H9c2细胞形态和体积明显增大，ANP、BNP、β-MHC、MMP-1、MMP-9、TIMP-1等肥大基因蛋白表达均有所上升，证明了AngⅡ刺激H9c2细胞促进心肌重构，而坎离颗粒可部分逆转AngⅡ引起的心肌细胞肥大，提示坎离颗粒对心肌组织具有显著的保护作用，其药理机制可能是通过抑制心肌肥大相关因子的表达，减缓肌原纤维的合成，从而改善心肌肥大与心肌重构的程度，进而改善心脏功能，发挥抗CHF的作用。更加深入的药理机制将会在未来的研究中进一步探索。