微小染色体维持蛋白10在神经胶质瘤中的表达水平及其对临床预后的影响

王森，刘萱，王天路，黄保胜，文立利，张雅旋，曹博强, 徐笑，张寅

神经胶质瘤是临床上常见的神经系统恶性肿瘤之一，发病率约占所有颅内肿瘤发病率的30%～40%，其具有起病隐匿、恶性程度高等特点，大多数患者被发现时已达疾病晚期[1-2]。因此，临床上急需寻找可用于早期诊断神经胶质瘤并能有效评估预后的分子靶标，以改善患者的预后。微小染色体维持蛋白(minichromosome maintenance，MCM)家族是广泛存在于真核生物的一类高度保守的蛋白质，于20世纪80年代在筛选酿酒酵母菌突变体的研究中被首次发现并命名，迄今为止，研究人员共发现10个MCM家族成员，它们之间具有高度同源性[3-4]。目前研究结果表明，在MCM家族的8个成员中，有7个成员(MCM2～7及MCM10)主要参与真核生物体DNA复制过程，MCM10在胶质瘤中具有不同程度的表达，参与脑细胞增殖等生理过程，但其对神经胶质瘤患者预后的影响目前鲜见报道[5-6]。本研究选取神经胶质瘤患者60例，通过检测其肿瘤组织中的MCM10表达情况，旨在探讨MCM10对神经胶质瘤患者临床特征及预后的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取南京医科大学第一附属医院神经外科2013年12月至2017年3月收治的神经胶质瘤患者60例，其中男34例，女26例；年龄11～74岁，平均(43.82±8.73)岁。首发症状：头痛21例，肌力降低15例，头晕11例，呕吐11例，另有8例患者伴面部感觉运动障碍、肢体感觉异常及癫痫等症状。入组患者术前Karnofsky(KPS)评分30～90分，中位数为65分。本研究经医院伦理委员会审查批准(审批号:2016年科研第22号)，所有患者或家属签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 术前评估及治疗方法 术前用磁共振成像(MRI)扫描患者头颅，根据肿瘤位置、大小分别选择经皮质侧脑室前角、经皮质侧脑室后角、经皮质侧脑室三角区及经胼胝体-苍穹间入路行手术切除，术中常规留取肿瘤组织行病理学检查。术后7 d复查所有患者头颅MRI，以此判断肿瘤切除程度。具体评价标准如下，①完全切除：未见肿瘤残留；②近全切除：可见肿瘤部分残留，残留体积<切除前的10%；③部分切除：可见肿瘤残留，残留体积≥切除前的10%。术后13例行单纯放疗，8例行单纯化疗，29例行放疗联合化疗，10例未采取任何辅助治疗措施。

1.2.2 肿瘤病理学检查及WHO分级 术后对肿瘤组织行病理学检查，按世界卫生组织(WHO)分类将其分为4级(Ⅰ～Ⅳ级)，其中Ⅰ～Ⅱ级为低级别，Ⅲ～Ⅳ级为高级别。本组60例患者中WHO Ⅰ级10例，Ⅱ级21例，Ⅲ级16例，Ⅳ级13例。

1.2.3 免疫组织化学染色检测MCM10表达情况

将术中取得的肿瘤组织标本行石蜡包埋，选取肿瘤组织丰富的3张切片，采用链霉素亲和素-过氧化物酶偶联法染色，以MCM10多克隆抗体(1∶500，美国Alcam公司)作为一抗，生物素化山羊抗家兔IgG(1∶50，美国Alcam公司)作为二抗。染色成功后，采用显微镜成像系统(德国ZEISS公司)扫描，应用Image J软件对切片阳性率及染色强度进行评分。评分标准：①细胞核为棕褐色或棕黄色表示组织中MCM10表达阳性，阳性率>75%记4分，50%<阳性率≤75%记3分，25%<阳性率≤50%记2分，阳性率≤25%记1分；细胞核为棕褐色记3分，棕黄色记2分，淡黄色记1分，未着色记0分；②将染色强度评分与阳性率的乘积作为免疫组织化学得分的最终得分，9～12分为强阳性，4～8分为阳性，1～3分为弱阳性，0分为阴性；③MCM10表达判定标准：乘积得分≥6分为高表达，乘积得分<6分为低表达[7]。

1.3 术后随访

出院后采用门诊或电话的方式对患者进行随访，随访截止到2020年12月，达随访终点或患者死亡定义为随访结束。随访内容包括：术后间隔3个月复查头颅MRI(平扫+增强)，以评价肿瘤复发情况；术后3个月复查KPS评分，以评价症状改善情况。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 神经胶质瘤患者手术及随访结果

60例神经胶质瘤患者术后7 d复查头颅MRI结果显示，肿瘤完全切除21例(35.00%)，近全切除37例(61.67%)，部分切除2例(3.33%)。60例神经胶质瘤患者随访0.3～36.0个月，中位时间22.9个月；KPS评分0～100分，中位数65分；其中22例(36.67%)改善，10例(16.67%)无明显变化，28例(46.67%)评分降低。到随访期结束，35例存活，其中10例复发，行二次手术治疗；25例死亡，其中16例死于神经胶质瘤复发，6例死于术后并发症，3例死因不明。

2.2 神经胶质瘤患者MCM10蛋白表达情况

60例患者肿瘤组织中均检测到不同程度的MCM10蛋白表达，依据免疫组织化学得分，29例为低表达，31例为高表达。WHO分级Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级患者MCM10蛋白表达得分分别为(3.71±1.20)分、(5.84±2.26)分、(7.53±3.51)分、(7.89±2.82)分，差异有统计学意义(F=11.508，P<0.05)。两两比较显示，WHO Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级患者MCM10蛋白表达明显高于WHO Ⅰ级患者，差异有统计学意义(P<0.05)，WHO Ⅳ级患者MCM10蛋白表达水平明显高于WHO Ⅱ级患者，差异有统计学意义(P<0.05)，其他分级之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 MCM10蛋白低表达组与高表达组神经胶质瘤患者的临床资料比较

MCM10蛋白低表达组与高表达组患者的年龄、性别、术前KPS评分、WHO分级、术后辅助治疗及术后复发比例等比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 MCM10蛋白低表达组与高表达组神经胶质瘤患者的临床资料比较

2.4 MCM10蛋白低表达组与高表达组神经胶质瘤患者的生存曲线比较

MCM10蛋白高表达组患者的生存时间明显低于MCM10蛋白低表达组，差异有统计学意义(Log-rankχ2=4.250，P<0.05)。至随访期末，共26例患者复发，生存曲线分析结果显示，在复发的患者中，MCM10蛋白高表达组患者的生存时间明显短于MCM10蛋白低表达组，差异有统计学意义(Log-rankχ2=3.535，P<0.05)，见图1、图2。

图1 MCM10蛋白低表达组与高表达组神经胶质瘤患者的生存曲线

图2 复发患者中MCM10蛋白低表达组与高表达组神经胶质瘤患者的生存曲线

2.5 影响神经胶质瘤患者预后的单因素和多因素Cox回归分析

单因素Cox回归分析结果显示，肿瘤WHO分级、术后复发、肿瘤切除程度及MCM10蛋白表达水平是影响神经胶质瘤患者预后的影响因素(P<0.05)。进一步将上述指标纳入多因素Cox回归分析，结果显示，肿瘤WHO分级高、术后复发及MCM10蛋白表达水平高是影响神经胶质瘤患者生存的危险因素(P<0.05)。见表2。

表2 影响神经胶质瘤患者预后的单因素和多因素Cox回归分析

3 讨论

神经胶质瘤是神经外科的常见疾病之一，可发生于任何年龄，以40～60岁多见，文献报道该病的男女患病比例差异无统计学意义[8-9]。神经胶质瘤的临床表现多种多样，早期缺乏特异性症状，患者病程可为数周至数年，呈进行性发展。常见的临床表现包括头痛、精神症状、局灶性运动功能损害、抽搐及震颤等。神经胶质瘤临床表现的不确定性与肿瘤的弥漫性生长破坏了大脑皮层之间以及大脑皮层与其下级中枢的联系有关，早期诊断较困难[10-12]。近年来，随着临床诊断学的发展以及实验技术水平的提高，临床医师们致力于寻找有关神经胶质瘤早期诊断及预后评价的指标，以期改善患者预后。

MCM蛋白质家族是广泛存在于真核生物体内的一类蛋白质。早期有学者研究发现，MCM蛋白的异常表达尤其是过表达，在诸多人类癌前病变及癌症中都有发现，如结肠癌、前列腺癌、脑膜瘤、胃腺癌、骨肉瘤及乳腺癌等[13]。MCM蛋白家族成员异常表达已成为多种恶性肿瘤的生物学标志物。其中，MCM2是肾细胞癌、少突胶质细胞、乳腺癌、喉癌、卵巢癌、口腔癌等的生物学标志物，MCM3是甲状腺乳头状癌的生物学标志物，MCM4是非小细胞肺癌的生物学标志物，MCM5是前列腺癌和卵巢癌的生物学标志物，MCM6是原发性肝癌的生物学标志物，MCM7是小细胞肺腺癌、结直肠癌、口腔鳞癌的生物学标志物[14-17]。MCM10是近年来新发现的MCM蛋白质家族成员，研究表明，MCM10在宫颈癌发生发展不同阶段的表达水平均高于周围正常组织[18-19]。Weller等[20]采用RT-PCR及微阵列计数对神经胶质瘤患者的MCM10表达水平进行定量分析，证实在WHO病理分级Ⅲ～Ⅳ级的神经胶质瘤患者中，MCM10表达水平随病理分级的增加而增加。本研究结果显示，WHO分级Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级患者MCM10表达得分分别为(3.71±1.20)分、(5.84±2.26)分、(7.53±3.51)分、(7.89±2.82)分，差异有统计学意义。MCM10蛋白低表达组神经胶质瘤患者的生存时间明显长于MCM10蛋白高表达组，差异有统计学意义。在26例复发患者中，MCM10蛋白低表达组的生存时间明显长于MCM10蛋白高表达组，差异有统计学意义。说明在预后差及复发患者的神经胶质瘤组织中,MCM10蛋白表达水平明显增高。Cox回归分析筛选神经胶质瘤患者预后的影响因素结果显示，肿瘤WHO分级高、术后复发及MCM10蛋白高表达是影响神经胶质瘤患者预后生存的独立危险因素。提示MCM10可作为评判神经胶质瘤预后的指标之一。

综上所述，神经胶质瘤患者肿瘤组织中均有不同程度的MCM10表达，其表达水平在WHO Ⅰ～Ⅳ级患者中逐渐增加。MCM10高表达患者的生存期较短，且术后肿瘤易复发，临床上可将肿瘤组织MCM10表达水平作为神经胶质瘤预后评价的指标。