固相阻断ELISA法检测口蹄疫病毒O型抗体的不确定度评定

王佳璟，何学东，杨 芳

(浙江康嘉基因技术有限公司，浙江 杭州 310021)

口蹄疫病毒(FMDV)属于小RNA病毒科口疮病毒属。目前有7个血清型，各型之间几乎没有交叉免疫保护力，因此，每次爆发后只能屠宰和集体焚毁染病牲畜以绝后患。由于口蹄疫传播迅速、难于防治、补救措施少，被称为畜牧业的“头号杀手”，为我国强制免疫的动物疫病[1-2]。实际生产中，常使用ELISA检测方法进行口蹄疫的免疫情况监督和诊断[3-4]。

测量不确定度[5-6]简称不确定度，是各种不确定度的一个总称或通称，包括：标准不确定度[7]、合成不确定度[8]、扩展不确定度[9]、相对不确定度[10]、A类不确定度[11]、B类不确定度[12]等。不确定度是指测量结果的可疑程度，是测量结果可疑程度的一种定量表述，可定量说明实验室的测量能力水平。只有在得到不确定度的值后，才能明确被测量真值所处范围及这个范围的大小。为向养殖户提供更好的免疫参考意见和更精准的诊断结果，实验室需要进行不确定度评定[13-14]。

本文拟以探讨血清实验室固相阻断ELISA法检测口蹄疫病毒O型抗体[15-16]的不确定度评定为例，介绍ELISA试验测量不确定度的两种方法：“影响因素分析法”[17]和“对照样品法”[18]。

1 材料与方法

仪器：Eppendorf 10-100 μL单、8道可调移液器；Eppendorf 30-300 μL 8道可调移液器；上海博讯BPS-100生化培养箱；TECAN Infinite F50酶标仪。

试剂：口蹄疫病毒(FMDV)O型抗体ELISA检测试剂盒(固相阻断ELISA法，北京金诺百泰生物技术有限公司，批号：20211203)。

操作步骤：试验前将试剂盒所有组分恢复至室温，10x浓缩洗涤液进行10倍稀释，用样品稀释液5倍稀释待检样品，对照样品同样方法稀释。

(1)取出抗原包被板，在记录表上记录样品的位置。

(2)在包被孔内分别加入100 μL已稀释好的阴性对照和阳性对照，重复两孔。在相应孔中加入100 μL已稀释好的样品，注意每个样轻弹微量反应板或用振荡器振荡，将反应板中的溶液混匀。

(3)盖上封膜板，室温25 ℃下孵育1 h。

(4)弃去孔内液体，每孔加入300 μL洗涤液，洗涤3次，每次洗涤后，甩掉孔内的液体，在吸水材料上轻扣板。在最后一次甩干后，彻底拍去剩余的液体。在加入下一个试剂前，避免孔壁过干。

(5)每孔加入100 μL FMDV O型酶标抗体，盖上封模板，室温25℃下孵育1 h。

(6)重复1.3.6洗板步骤。

(7)每孔加入100 μL TMB显色液。

(8)室温25 ℃孵育15 min。

(9)每孔加入50 μL终止液，终止反应。

(10)利用酶标仪测量450 nm处被检样品OD值并记录。

结果计算与判定：阴性对照OD450平均值>0.7；阳性对照S/N平均值<0.3；如果检测结果不在界定范围需要重新进行检测。

(1)样品S/N=样品的OD值/阴性对照的OD平均值。

(2)S/N值>0.5，样品为阴性；S/N值≤0.5，样品为阳性。

2 影响因素分析法

2.1原理 通过对口蹄疫病毒O型抗体固相阻断ELISA检测的过程分析，找出检测过程中的不确定度的来源并进行系统分析，对各不确定度分量进行评定，给出该测量方法的合成不确定度及扩展不确定度。

2.2不确定度来源分析 不确定度评定包括加样时所用移液器的标准不确定度；环境温度引入的不确定度；酶标仪的不确定度；检测过程中因实际操作引入的不确定度(未知的随机因素)。

2.2.1A类不确定因素 由于本实验室使用ELISA检测口蹄疫病毒O型抗体，使用的是同一试剂盒同一样本，稀释倍数为5倍稀释，环境温度保存在25 ℃，由同一检测员进行检测，使用的移液器、酶标仪均为同一套，因此本实验室使用ELISA检测口蹄疫病毒O型抗体，除未知的随机因素，无其他A类不确定因素。由随机误差引起的，通过重复检测样品，其检测数据呈正态分布，可以采用统计方法分析，以此计算样本的均值、标准差和相对标准偏差。通过重复测定样品获得的相对标准偏差即样品的标准不确定度。本方法不确定度的分量来源包括样品标准偏差引起的A类标准不确定度，对同一份样品平行检测10次，检测结果见表1。

表1 血清中口蹄疫抗体(O型)的测定结果

检测结果的平均值：

标准偏差：

标准不确定度：

2.2.2移液器引入的不确定度(B类)

2.2.2.1 移液器加样的相对标准不确定度 试验中涉及到的移液器包括10-100 μL单道以及8道、30-300 μL 8道移液器等进行试剂和样品的添加，移液器在30 μL (稀释)、120 μL(稀释)、100 μL(加样)、100 μL(酶标二抗)、100 μL(底物)检定点或最近量程的容量U为2%、0.3%、0.3%、0.3%和0.3%，标准不确定度按照JJF 1059.1-2012测量不确定度评定，根据4.3.3.1表示公式为：

a:被测量可能值区间的半宽度，如根据广州广电计量检测股份有限公司的校准证书计算获得U，则a=加样量×U；

k:根据正态分布情况下，p为95%获得的k称置信因子，可根据移液器校准证书k=2。

移液器各加样的标准不确定度为：

U(30稀释)=30 μL×2%/2=0.3000 μL
U(120稀释)=120 μL×0.3%/2=0.1800 μL
U(100加样)=100 μL×0.3%/2=0.1500 μL
U(100酶标二抗)=100 μL×0.3/2=0.1500 μL
U(100底物)=100 μL×0.3/2=0.1500 μL

移液器加样的相对标准不确定度为：

U(移液器)=[U2(30稀释)/302+U2(120稀释)/1202+U2(100加样)/1002+U2(100酶标二抗)/1002+U2(100底物)/1002]1/2=0.0104 μL

2.2.2.2 温度效应产生的不确定度 水的膨胀系数为2.1×10-4/℃，实验室温度在(25±3)℃，按照分布计算加样的标准不确定度为：

U(T30)=30 μL×3×2.1×10-4=0.0189 μL

U(T120)=120 μL×3×2.1×10-4=0.0756 μL

U(T100)=100 μL×3×2.1×10-4=0.0630 μL

U(T酶标二抗)=100 μL×3×2.1×10-4=0.0630 μL

U(T底物)=100 μL×3×2.1×10-4=0.0630 μL

则温度对稀释、加样、酶标二抗、底物的相对标准不确定度为：

u(T)=[U2(T30)/302+U2(T120)/1202+U2(T100)/1002+U2(T酶标二抗)/1002+U2(T底物)/1002]1/2=0.0014

2.2.2.3 移液器产生的合成相对标准不确定度u(P)=[u2(C)+u2(T)]1/2=0.0054

2.2.3温育时间的不确定度(B类) 试验中，孵育时间分别为1 h(±2 min)、1 h(±2 min)、15 min(±1 min)，根据均匀统计分布计算，其标准差分别为2 min/31/2=1.1547 min，2 min/31/2=1.1547 min，1 min/31/2=0.5774 min。

u(T1)=[1.15472/602+1.15472/602+

0.57742/152]1/2=0.0471

温育温度的不确定度(B类) 试验共需孵育3次，孵育温度均为25 ℃±3 ℃，根据均匀统计分布计算，其标准差分别为3/31/2=1.7321，温育温度的相对标准不确定度为：

u(T2)=[3×1.73212/252]1/2=0.1200

2.2.4酶标仪的不确定度(B类) 酶标仪不确定度由广州广电计量检测股份有限公司的校准证书获得，酶标仪的设定波长为450 nm时的吸光度扩展不确定度(U，k=2)为0.012，标准不确定度为：

2.2.5相对标准不确定度的合成 按照下列公式计算：

u(B类)=

取置信水平P=95%，K=2，则最佳估计值的扩展不确定度为：

根据上述测得的不确定度，在实际检测过程中，在95%的置信区间，阻断率(95%置信)=实际测得S/N±U。解释：在95%的置信度下，检测结果的真实S/N值在实际测得S/N±0.2593这个区间。所测得的不确定度在阈值水平上的应用为S/N=0.5±(0.5×0.2593)= 0.5±0.1297。解释：在95%的置信度下，如果检测结果S/N值<0.3703时，可明确判定为阳性，同样，如果检测结果S/N值≥0.6279时，可明确判定为阴性。

3 对照样品法

原理：选择一个弱阳性对照血清作为质控样品，进行有限次的ELISA重复试验，计算出检测结果的平均值、标准偏差(SD)、相对标准偏差(RSD)。假设数据以正态分布，在阈值附近以95%置信水平计算。扩展不确定度即为：2乘以RSD。即利用质控样品对口蹄疫抗体(O型)ELISA检测方法的全过程和性能进行监控，直接评估该试验过程的合成不确定度。

用固相阻断ELISA法对血清中的抗体水平测定进行10次平行试验，结果见表1。根据前面计算可知，检测结果的平均值为0.3619，标准偏差为0.0376，那么相对标准偏差就为：

假设数据以正态分布，在阈值附近以95%置信水平计算，ELISA试验中的k=2。扩展不确定度U=RSD×2，即U=2×0.1040=0.2080。

结果：根据上述测得的不确定度，在实际检测过程中，在95%的置信区间，阻断率(95%置信)=实际测得S/N±U。解释：在95%的置信度下，检测结果的真实S/N值在实际测得S/N±0.2080这个区间。所测得的不确定度在阈值水平上的应用为S/N=0.5±(0.5×0.2080)=0.5±0.1040。解释：在95%的置信度下，如果检测结果S/N值<0.3960时，可明确判定为阳性，如果检测结果S/N值≥0.6040时，可明确判定为阴性。

4 讨论

使用“影响因素分析法”和“对照样品法”两种方法，分别对血清实验室固相阻断ELISA法检测口蹄疫病毒O型抗体进行不确定度评定，两种方法得出的结论略有差异。

“影响因素分析法”对整个试验的影响因素进行独立的分析，得出数据接近理论值，有助于实验室分析检测活动中的注意事项，提高试验的确定度，适用于对新方法的不确定度评定。对各影响因素的相对不确定度进行比对可得：温度对移液器移液影响可忽略，故移液器引入的不确定度主要在移液器本身，实验室需加强对移液器的校准和期间核查；温育温度、温育时间对ELISA试验影响较大，控制温育时间引入的不确定度需使用计时器，并即时进行操作，控制温育温度引入的不确定度应使用生化培养箱温育，并即时校准生化培养箱；控制酶标仪引入的不确定度，需即时校准酶标仪。

“对照样品法”利用质控样品对口蹄疫病毒O型抗体固相阻断ELISA检测方法的全过程和性能进行监控，直接评估该试验过程的合成不确定度，减少大量计算过程，快速得出结论，贴合实验室实际情况。“影响因素分析法”和“对照样品法”计算的不确定度数值差异应来自于实验室对温育温度、温育时间的严格把控。