双参四白胶囊有效成分的定性鉴别与含量测定

梁林辉 赵 君 彭 东 何钰兴 姚永秀 田近民 章 斌*

1.雅安职业技术学院 药学与检验学院，四川 雅安 625000； 2.成都高新独特中医药研究中心，四川 成都 610000

双参四白胶囊由丹参、当归、川芎、白芍、赤芍、白芷、白及、蒺藜、莪术、红参10味中药组成，胶囊内容物棕褐色、气香、味微辛、微苦。主要功效为养血润肤，活血通络，益气祛风。其中，君药丹参归心、肝经，活血祛瘀、通经止痛、养血安神[1]；红参大补元气，复脉固脱，益气摄血[2]；佐以川芎、赤芍、白芍、白芷、白及、蒺藜、莪术活血行气、养血调经、祛风止痛、消肿生肌。用于血虚络阻，肌肤失养所致的外阴白斑症。双参四白胶囊为院内方剂，在治疗外阴白斑方面取得了良好的临床疗效，预申报医院制剂，其工艺已经确定，实验及中式完成。本文研究该制剂薄层鉴别和含量测定两项主要质量标准项目，建立了薄层色谱法对双参四白胶囊中丹参、白芷、当归、川芎四种成分定性鉴别，同时建立了HPLC法测定双参四白胶囊中丹参酮ⅡA含量的方法，以期为双参四白胶囊的质量标准研究方法的确立提供实验基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津Essentia LC-16高效液相色谱仪；岛津AUW120D分析天平；JM·A30002电子天平；沃特世Symmetry-C18色谱柱；KQ-00DB数控超声波清洗器；硅胶G薄层板；ZF-1三用紫外仪。

1.2 试药 双参四白胶囊(批号：20210530-1、20210530-2、20210528-1)，丹参酮ⅡA对照品(中检所，批号：110766-202022，含量98.9%，含量测定及薄层鉴别用)；丹参对照药材(雅安职业技术学院自制，批号：2011007，薄层鉴别用)；白芷对照药材(成都瑞芬思，批号：DZYC-B-006);当归对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：RL6S-21MD)；川芎对照药材(上海源叶，批号：Y06M10H82338)。

1.3 试剂 色谱纯甲醇(赛默飞，批号：LOT 210774)；纯化水为市售怡宝纯净水；其他试剂(分析纯)均为市售常规试剂。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 丹参的薄层鉴别 取双参四白胶囊内容物2 g，加石油醚15 mL，搅拌均匀，超声处理30 min，3000 r/min离心5 min，收集上清液，挥干石油醚，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作为供试品溶液。取丹参对照药材，粉碎，过60目筛，称取1 g，按双参四白胶囊供试品溶液方法制备丹参对照药材溶液。再取丹参酮ⅡA对照品2.5 mg，加乙酸乙酯5 mL，超声处理5 min，制成每1 mL含0.5 mg的对照品溶液。取缺丹参的双参四白胶囊阴性样2 g，参照供试品处理方法制成阴性对照溶液。照2020版药典(通则0502)试验，在同一硅胶G薄层板上，供试品、阴性对照、对照药材及丹参酮ⅡA对照品溶液分别点样8 μL，以二氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(6∶4∶8∶1∶4)为展开剂，展开约4 cm，取出，晾干，再以石油醚-乙酸乙酯(4∶1)为展开剂[3]，展开约10 cm，取出，热风干燥，可见光下直接检视。供试品、丹参对照药材和丹参酮ⅡA对照品色谱在相应的位置上显相同橙红色的斑点，阴性对照无干扰(如图1所示)。

2.1.2 白芷的薄层鉴别 取双参四白胶囊内容物5 g，加2%碳酸钠40 mL，搅拌均匀，超声处理15 min，3000 r/min离心5 min，弃上清液，加水20 mL，摇匀，3000 r/min离心5 min，弃上层水液；加20 mL石油醚，搅拌，超声处理15 min，3000 r/min离心5 min，收集上层石油醚溶液，挥干石油醚，加乙酸乙酯1 mL溶解残渣，作为供试品溶液。取缺白芷的双参四白胶囊阴性样5 g，参照供试品处理方法制成阴性对照溶液。另取白芷对照药材0.5 g，按上述方法制成对照药材溶液。照2020版药典(通则0502)试验，在同一硅胶G薄层板上，供试品、缺白芷阴性对照和白芷对照药材溶液分别点样5 μL，以环己烷-乙酸乙酯-苯(9∶1∶5)为展开剂，展开约10 cm，取出，热风干燥，365 nm紫外光下检视。供试品和白芷对照药材色谱在相应的位置上显2个相同淡黄色的斑点，阴性对照无干扰(如图2所示)。

1：丹参酮IIA对照品溶液；2～4：双参四白胶囊20210530-1、20210530-2、20210528-1溶液；5：缺丹参阴性对照溶液；6：丹参对照药材溶液图1 丹参薄层鉴别色谱图

1：白芷对照药材溶液：2～4：双参四白胶囊20210530-1、20210530-2、20210528-1溶液；5：缺白芷阴性对照溶液图2 白芷薄层鉴别色谱图

2.1.3 当归和川芎的薄层鉴别 取双参四白胶囊内容物5 g，加石油醚30 mL，搅拌均匀，超声处理30 min，3000 r/min离心5 min，收集上清液，挥干，加乙酸乙酯1 mL溶解残渣，作为供试品溶液。取缺当归、缺川芎、缺当归和川芎的阴性对照样各5 g，同法分别制成缺当归、缺川芎、缺当归和川芎三种阴性对照溶液。另分别取川芎、当归对照药材各0.5 g，按上述方法制成对照药材溶液。照2020版药典(通则0502)试验，在同一硅胶G薄层板上，吸取供试品溶液、缺当归阴性对照溶液、缺川芎阴性对照溶液、缺当归和川芎阴性对照溶液和当归、川芎对照药材溶液各5 μL，以石油醚-正己烷-乙酸乙酯(8∶3∶1)为展开剂，展开约10 cm，取出，热风干燥，254 nm紫外光下检视。与供试品色谱及对照品相比，缺当归和川芎的阴性对照在与对照药材色谱相应的位置上，缺少1个淡蓝色荧光和一个蓝紫荧光斑点(如图3所示)。

1：川芎对照药材溶液；2：当归对照药材溶液；3：缺川芎阴性对照溶液；4：缺当归阴性对照溶液；5：双参四白胶囊20210530-1；6：缺当归、川芎阴性对照溶液图3 当归、川芎薄层鉴别色谱图

2.2 丹参酮ⅡA的含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Waters Symmetry-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相为甲醇∶水=73∶27(V/V)；检测波长为270 nm；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min；进样体积：10 μL。理论板数按丹参酮ⅡA峰计算应不低于5000。结果表明，样品中丹参酮ⅡA峰分离较好，峰形对称，并且阴性无干扰，该法专属性良好(如图4所示)。

注：A.丹参酮ⅡA对照；B.供试品；C.阴性对照品图4 双参四白胶囊HPLC色谱图

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称定丹参酮ⅡA对照品，置25 mL棕色容量瓶中，加甲醇制成每 1 mL 含200 μg的溶液即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密称定双参四白胶囊内容物约0.5 g，置25 mL棕色容量瓶中，加入甲醇20 mL，超声处理15 min，放冷，甲醇定容，滤过，收集滤液即得。

2.2.4 阴性对照溶液的制备 取缺丹参双参四白胶囊阴性样品，按照上述“2.2.3”方法制备即得。

2.2.5 线性关系考察 精密量取丹参酮ⅡA对照品溶液适量，置10 mL容量瓶中，加甲醇摇匀，定容，制成质量浓度分别为4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、160 μg/mL的对照品溶液。按“2.2.1”项下色谱条件检测，以峰面积为纵坐标，对照品浓度(μg/mL)为横坐标绘制标准曲线如图5所示；丹参酮ⅡA的回归方程、相关系数、线性范围见表1。结果表明丹参酮IIA的线性关系良好。

表1 线性回归方程、线性范围、相关系数

图5 丹参酮IIA标准曲线图

2.2.6 精密度试验 参照“2.2.1”项下色谱条件，选取“2.2.5”项下浓度为16 μg/mL丹参酮ⅡA对照品，连续进样5次，丹参酮ⅡA的峰面积RSD为 0.16%，仪器精密度良好。结果见表2。

2.2.7 重复性试验 精密称定双参四白胶囊样品6份(批号：20210530-1)，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，依照“2.2.1”项下色谱条件检测，根据丹参酮ⅡA峰面积值，计算丹参酮ⅡA的含量和RSD值。结果见表3，丹参酮ⅡA含量的RSD值为1.37%，重现性较好。

表2 精密度试验 (n=5)

表3 重复性试验

2.2.8 稳定性试验 精密称定双参四白胶囊样(批号：20210530-1)约0.5 g，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液。按“2.2.1”项下色谱条件，于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h检测，根据丹参酮ⅡA峰面积值计算RSD值。由表4可知，丹参酮ⅡA峰面积的RSD值为0.65%，供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.2.9 加样回收率试验 精密称定双参四白胶囊样9份(批号：20210530-1)，每份约0.5 g，三份1组，共3组。第一组3份分别加入相当于样品含量80%丹参酮ⅡA对照品溶液，第二组3份分别加入相当于样品含量100%对照品溶液，第三组3份分别加入相当于样品含量120%的对照品溶液。按本文供试品制备方法和色谱条件进行检测，根据丹参酮ⅡA峰面积值并计算回收率。由表5可知，丹参酮IIA平均加样回收率为100.67%，RSD值为2.77%，该方法的准确度较好。

表4 稳定性试验

表5 加样回收率试验结果 (n=9)

2.2.10 样品含量测定 取丹参药材、三批次双参四白胶囊(批号：20210530-1、20210530-2、20210528-1)样品各两份，每份约0.4 g，按本文供试品制备方法和色谱条件进行检测，计算指标成分的含量，结果见表6。结果表明，三批次双参四白胶囊中丹参酮ⅡA含量稳定。处方中，丹参115 g，总量385 g，转移率为65.34%。计算公式如下：

转移率

3 讨论

双参四白胶囊由10味中药组成，多味药物存在相似成分。白芷、当归、川芎中均含有香豆素类、挥发油等结构相似成分[4-7]，莪术同样含有大量的挥发油成分[8]；白芍、赤芍都含有芍药苷[9-10]；蒺藜和红参主要成分为皂苷类[11-13]。因此，相似的成分可能会对薄层鉴别产生较大的干扰，为薄层鉴别带来难度。

3.1 薄层色谱条件选择

3.1.1 丹参薄层鉴别 在薄层色谱鉴别中，本试验中分别对提取溶剂和展开剂进行了优化筛选。在丹参的薄层鉴别中，药典中丹参鉴别采用乙醇作为提取溶剂，但复方制剂中，药物成分复杂，可通过降低溶剂极性，减少阴性干扰。有文献报道，复方制剂中丹参的薄层鉴别采用乙醚作为提取溶剂[14-15]，考虑到乙醚的特殊气味及麻醉性，本文采用极性相近的石油醚作为提取溶剂。本文处理比较了展开系统Ⅰ[三氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(6∶4∶8∶1∶4)],展开系统Ⅱ[三氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(6∶4∶8∶1∶4)；展开4 cm，晾干，再用石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(4∶1)展开]，展开系统Ⅲ[三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(6∶5∶1)] 3种不同展开剂对色谱情况的影响，研究发现3种展开系统均分离良好，阴性无干扰，在使用三氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(6∶4∶8∶1∶4)及石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(4∶1)双展开系统展开时，丹参斑点分度更大，斑点更清晰，选取展开系统Ⅱ作为双参四白胶囊中丹参薄层鉴别的展开系统。

3.1.2 白芷薄层鉴别 2020版中国药典中白芷药材鉴别使用的展开系统为石油醚(30～60 ℃)-乙醚(3∶2)，同样在梁璐[16]的白芷饮片的薄层鉴别和指纹图谱研究及展月等[17]的麝香壮骨膏的薄层鉴别及乌头碱限量的检查方法研究中，鉴别白芷均采用石油醚(30～60 ℃)-乙醚(3∶2)展开系统。本试验首先排除使用乙醚，并尝试比较了环己烷-乙酸乙酯(9∶1)、环己烷-乙酸乙酯-苯(9∶1∶5)、石油醚(30～60 ℃)-甲苯-乙酸乙酯(8∶5∶1)、正己烷-乙酸乙酯(3∶1)4种不同展开系统对色谱情况的影响，发现4种展开系统均分离良好，在展开系统环己烷-乙酸乙酯-苯(9∶1∶5)为展开剂中展开，斑点颜色明显，阴性干扰小。

3.1.3 当归和川芎薄层鉴别 当归、川芎两药中含有相同和相似的化学成分，如阿魏酸、藁本内酯、欧当归内酯、尿嘧啶等，在进行鉴定时，常以相同成分作为鉴定两药的标准[6]。本文比较了石油醚-正己烷-乙酸乙酯(8∶3∶1)、环己烷-乙酸乙酯(9∶1)、环己烷-乙酸乙酯-苯(9∶1∶5)、石油醚(30～60 ℃)-甲苯-乙酸乙酯(8∶5∶1)、正己烷-乙酸乙酯(3∶1)5种不同展开系统对色谱情况的影响，发现石油醚-正己烷-乙酸乙酯(8∶3∶1)作为展开剂时，分离效果较好，斑点清晰，阴性干扰小，边缘效应小。

3.2 高效液相色谱条件选择 结合化合物的相关性质，本实验试用色谱柱：Waters Symmetry-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)、Ecosil ODS Extend-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)。结果：两种色谱柱分离度均良好，理论塔板数>5000。因此，本试验选择Waters Symmetry-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)柱。参考相关文献及2020版《中国药典》，最终设定检测波长为270 nm；以甲醇-水(73：27)为流动相；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃。样品中丹参酮ⅡA色谱峰与杂质峰分离完全，峰形较好。

本研究采用薄层色谱法建立了双参四白胶囊中丹参、白芷、当归、川芎四味药定性鉴别方法和HPLC法测定双参四白胶囊中丹参酮ⅡA含量的方法，实验摸索选定的薄层色谱条件分离度好，专属性强，阴性干扰少，操作简便快捷；高效液相色谱法精密度高，重现性好，结果准确可靠。本实验为双参四白胶囊的质量控制和质量标准的建立提供了科学依据，为进一步制剂开发和临床应用奠定了药学基础。