天然植物当归中藁本内酯含量测定方法的建立

仝文科， 杜红娜★，朱明月 ，聂晓博 ，张延华 ，崔克争，孔素叶

（1.中农翎翔河北生物科技有限公司，河北行唐 050699；2.石家庄医学高等专科学校，河北灵寿 050200；3.行唐县动物卫生监督所，河北行唐 050699；4.行唐县畜牧局动物疫病预防控制中心，河北行唐 050699）

当归为伞形科植物当归Angelicasinensis（Oliv.）Diels 的干燥根， 作为117 种药食同源的可饲用天然植物被列入《饲料原料目录》。 当归是补血圣药，素有“十方九归”之称。 随着畜牧业快速发展，具有绿色、安全、环保优势的天然植物被广泛应用于临床， 天然植物的应用必将引领我国畜牧业向绿色生态方向发展。 目前，关于天然植物的研究也越来越多， 现代药理学研究发现，当归对畜禽机体血液系统、免疫系统等均具有显著的药理作用。 现代研究表明，当归传统功效的物质基础主要是挥发性成分、有机酸类、多糖类等，当归中挥发油主要成分为藁本内酯、正丁烯基内酯、当归酮、香荆芥酚等[1，2]。 目前，药典“当归”饮片项下只有阿魏酸含量测定方法，没有对藁本内酯进行含量规定。 因此，为了控制天然植物当归中藁本内酯的含量，因此，本研究拟建立一种准确可靠的当归中藁本内酯含量测定方法， 为当归饮片中藁本内酯的含量测定提供可借鉴的方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters e2695-2998 （美国） 高效液相色谱仪。

Symmetry C18（5 微米，250 毫米×4.6 毫米）色谱柱；e2695 泵，Empower3 数据处理软件系统；2998 PDA 检测器。

1.2 药物与试剂

藁本内酯对照品 （上海纯优生物科技有限公司，供含量测定用，含量以98%计）。 甲醇：色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.3 药材

当归药材购于安国药材市场， 经本公司质控部鉴定符合《中华人民共和国兽药典》2020 版（Ⅱ部）项下有关规定[1]。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Sy 毫米etry C18 （5 微米，250 毫米×4.6 毫米），C18 预柱。 流动相：甲醇-0.5%醋酸（65：35）。流速：1.0 毫升/分钟。柱温：30℃。 检测波长：324 纳米。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取藁本内酯约10 毫克， 置10 毫升量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液 （藁本内酯对照品贮备液的浓度为1.12 毫克/毫升）。 色谱图见图1。

图1 藁本内酯对照品高效液相色谱图

2.3 线性范围的考察

分别精密量取藁本内酯对照品贮备液（1.12毫克/毫升）0.5 毫升， 三份， 分别置25 毫升、50毫升、100 毫升量瓶中； 分别精密量取藁本内酯对照品贮备液1.0 毫升，三份，分别置5 毫升、10毫升、25 毫升量瓶中；精密量取藁本内酯对照品贮备液2 毫升置5 毫升量瓶中，上述样品，均加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。各进样10 微升，记录色谱图，分别测定峰面积值，结果见表1。 并以峰面积值（y）对样品浓度（x）进行线性回归，得标准曲线方程：

表1 藁本内酯对照品峰面积测定结果

y =15668678.93 x-1373.53，r = 1.0000

以峰面积值（y）-样品浓度（x）作图，得一直线（见图2）。 试验结果表明：在0.006～0.480 毫克/毫升范围内， 藁本内酯的峰面积值与样品浓度有良好的线性关系（见表1）。

图2 标准曲线图

2.4 供试品溶液的制备

2.4.1 提取方式考察

超声提取法： 取本品粉末 （过三号筛）0.5克，精密称定，置100 毫升具塞锥形瓶中，加甲醇50 毫升，超声提取40 分钟，过滤，滤液用甲醇定容至100 毫升量瓶，即得；

回流提取法： 取本品粉末 （过三号筛）0.5克，精密称定，置100 毫升具塞锥形瓶中，加甲醇50 毫升，加热回流提取1 小时，过滤，滤液用甲醇定容至100 毫升量瓶，即得；

索氏提取法： 取本品粉末 （过三号筛）0.5克，精密称定，置100 毫升具塞锥形瓶中，加甲醇适量，索提4 小时后，放冷，定容至100 毫升量瓶，即得。

将定容后三份样品摇匀，滤过，取续滤液进样，分别测定含量，结果见表2。

表2 不同提取方法的比较（n=2）

结果表明， 索氏提取法藁本内酯含量相对较高，但是三种方法差异较小，因超声提取方法简捷易行，故确定提取方式为超声提取法。

2.4.2 提取溶媒考察

取本品粉末（过三号筛）0.5 克，精密称定，置100 毫升具塞锥形瓶中，分别加入不同的提取溶媒50 毫升，称定重量，超声提取40 分钟，提取液放冷后称定重量， 用提取溶媒补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液进样，分别测定含量，结果见表3。

表3 不同溶媒提取的比较（n=2）

以上结果表明， 甲醇所测定的藁本内酯含量大，故确定选择甲醇作为最佳提取溶媒。

2.4.3 提取溶媒用量考察

取本品粉末（过三号筛）0.5 克，精密称定，置100 毫升具塞锥形瓶中，分别加入不同量的甲醇，称定重量，超声提取40 分钟，提取液放冷后称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液进样，分别测定含量，结果见表4。

表4 不同溶媒用量提取的比较（n=2）

为保证提取完全，选取50 毫升作为最佳提取溶媒用量。

2.4.4 提取时间考察

取本品粉末（过三号筛）0.5 克，精密称定，置100 毫升具塞锥形瓶中，加甲醇50 毫升，称定重量，分别超声处理不同时间，放冷后用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液进样，分别测定含量，结果见表5。

表5 不同超声处理时间的比较（n=2）

以上结果表明，超声处理40～60 分钟，可提取完全，为节省时间成本，确定最佳超声处理时间为40 分钟。

2.4.5 供试品溶液色谱图

取本品粉末（过三号筛）0.5 克，精密称定，置100 毫升具塞锥形瓶中，加甲醇50 毫升，称定重量，超声处理40 分钟，放冷后用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液进样，色谱图见图3。

图3 当归供试品溶液高效液相色谱图

2.5 方法学考察

2.5.1 重复性考察

按取样量0.8∶1.0∶1.2 的比例分别称取样品，各平行三份，称定，按已确定的方法制备供试品溶液，测定峰面积值并计算藁本内酯含量。 试验结果表明， 藁本内酯平均含量为8.00 毫克/克，RSD 值 为 1.24% ，RSD ＜2%，该方法重复性良好。

2.5.2 精密度考察

取对照品溶液及重复性考察项下的供试品溶液各10 微升， 重复进样6 次，试验结果表明，对照品和供试品溶液藁本内酯面积值的RSD 值分别为0.24%和0.29%，RSD＜2%，该方法精密度良好。

2.5.3 稳定性考察

按已确定的方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12、24、36 及48小时，分别进样10 微升， 试验结果表明，样品中藁本内酯峰面积值的RSD值 为 0.31% ，RSD＜2%，供试品溶液在48 小时内稳定性良好。

2.5.4 回收率考察

设计三个不同浓度的对照品溶液，取已知含量的样品约0.25 克，分别精密加入高、中、低三个浓度的藁本内酯对照品溶液50 毫升， 每个浓度分别制备3 份供试品溶液进行测定，按确定的供试品溶液和色谱条件，分别制备加样回收供试品溶液并注入高效液相色谱仪，以下列公式计算回收率，结果见表6。

表6 回收率考察结果（n=3）

试验结果表明： 藁本内酯回收率在98%～102%，平均回收率为99.98%，RSD 值为1.35%，RSD＜2%，加样回收良好。

3 讨论

藁本内酯为当归挥发油的主要活性成分，故选择藁本内酯作为控制当归质量的指标性成分，本研究参照有关文献[3-7]，建立高效液相色谱法测定当归中藁本内酯含量。 在研究过程中，对供试品溶液制备方法进行考察，对提取方式（超声提取法、回流提取法、索氏提取法）、提取溶媒（水、50%甲醇、70%甲醇、甲醇、95%乙醇）、提取溶媒用量（20 毫升、50 毫升、100 毫升）和提取时间（20 分钟、30 分钟、40 分钟、50 分钟、60 分钟）进行考察， 在保证藁本内酯提取完全的情况下，综合考虑成本， 确定最佳提取方式为超声提取，提取溶媒为甲醇，溶媒用量为50 毫升，提取时间40 分钟。

南海军等[8]采用气相色谱测定了不同产地当归药材中藁本内酯的含量，结果显示甘肃产当归中藁本内酯的含量较高。 本研究，对当归道地药材种植区域（甘肃岷县、甘肃漳县）进行样品采集，包括新鲜样品及陈当归样品的采集，含量测定结果显示，道地药材中藁本内酯含量在13～22毫克/克， 新鲜当归药材中藁本内酯的含量要高于陈当归药材中的含量，而且藁本内酯的含量随着时间有所下降。

经多次试验验证， 高效液相色谱测定当归中藁本内酯含量的方法，分离效果好、灵敏度高、重复性好，准确度高，适用于天然植物当归中藁本内酯含量的测定。该方法可为药典“当归”饮片项下藁本内酯质量控制提供参考，以便更好地控制当归饮片质量，为畜禽产品提供更好的质量保障，为畜牧行业保驾护航。

（基金项目：石家庄市技术创新中心项目（中心名称： 石家庄市天然植物饲料添加剂技术创新中心）