水稻环境敏感雄性不育研究现状与挑战

彭国清，刘明龙，周 海，庄楚雄

(华南农业大学 生命科学学院/岭南现代农业科学与技术广东省实验室/亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室, 广东 广州 510642)

1 水稻环境敏感雄性不育的研究背景

1.1 杂交水稻发展与应用

水稻是世界至少一半人口依赖的粮食，随着人口的不断增长和可耕地面积的不断减少，需要不断提高单位面积粮食产量以保障粮食安全[1]。杂种优势是杂种F1代在多种性状(包括产量、适应性、抗性和品质等)上超过双亲的现象，在动植物中普遍存在[2-4]。杂交作物的产量往往比常规自交繁殖的产量高10%～20%，故杂交玉米、水稻、小麦和油菜等被广泛推广种植，成为提高作物产量的重要手段[5]。但是由于许多农作物是两性花，能够自花授粉，杂交制种时需要人工去雄，导致杂交制种效率低和成本高，其应用受到很大程度的限制；所以找到合适的雄性不育系，而且又能通过某种途径恢复其育性是关键。在20世纪70年代初，中国育种家发现野败型细胞质不育水稻，并很快育成了由不育系、保持系和恢复系组成的三系杂交水稻(第1代杂交水稻)，首次实现了杂交水稻的大规模应用，在中国、越南、印度尼西亚、菲律宾和美国等国家得到了广泛的推广，为保障人类粮食安全做出了重要贡献[6]。

随后，在20世纪70年代，中国科学家发现了水稻环境敏感雄性不育，并首创了以环境敏感雄性不育系和恢复系为核心的两系杂交水稻(第2代杂交水稻)，进一步推动了杂交水稻育种技术的发展[6-8]。相对于三系法水稻，两系法杂交水稻具有许多优势。首先，不像三系法受到严格的恢保关系限制，两系法不需要特殊的恢复基因，几乎所有正常品种都可作为恢复系，配组自由，选到优良组合的几率大大高于三系法，更加利于杂种优势的利用，在提高杂交稻组合的产量、米质、抗性等方面存在更大潜在优势；其次，育种程序简化，周期缩短和成本降低[6,9-10]。基于上述明显优势，两系杂交稻得到了迅速的发展。目前，多数的超级杂交稻组合都属于两系法杂交稻，两系杂交稻种植面积占总杂交水稻面积的一半以上[11]。

1.2 水稻环境敏感雄性不育的类型与基因克隆

植物的雄配子发育受到细胞质和细胞核遗传物质的精密调控，而且在生殖阶段最容易受到外界条件如光照、温度和湿度等因素的影响。植物在生理存活条件下，雄配子的发育易受到环境条件的影响而导致雄性不育称之为环境敏感雄性不育(Environment-sensitive genic male sterility，EGMS)。EGMS主要包括光敏雄性不育(Photoperiodsensitive genic male sterility，PGMS)、温敏雄性不育(Thermo-sensitive genic male sterility，TGMS)、湿敏雄性不育(Humidity-sensitive genic male sterility，HGMS)和氮敏感雄性不育(Nitrogen-sensitive genic male sterility，NGMS)。一般来讲，光敏雄性不育是指大于临界光照时间表现为雄性不育，小于临界光照时间则表现为雄性可育，反之称为反光敏雄性不育(Reverse PGMS, rPGMS)。同理，温敏雄性不育是指高于临界温度表现为雄性不育，低于临界温度则表现为雄性可育，反之则称为反温敏雄性不育(Reverse TGMS, rTGMS)。湿敏雄性不育指在低湿条件下表现为雄性不育，而在高湿条件下表现为雄性可育。氮敏感雄性不育在缺氮条件下表现为雄性不育，而高氮条件下为雄性可育。环境敏感雄性不育的育性对环境条件特别敏感，通过对其不育机理的研究，有助于理解生殖阶段的植物如何感应环境因子变化[12]。总之，对植物环境敏感型不育的调控机理进行研究，不仅有利于提高其在两系杂交育种中的利用水平，也利于理解植物如何感应环境变化，具有重要的理论和应用价值。

我国育种学家石明松于1973年首次发现的光敏雄性不育系‘农垦58S’(NK58S)，在日照长度大于14 h时表现为雄性不育，而日照长度小于13.7 h则育性恢复。根据此特点，在1981年首次提出了“长日杂交制种，短日自交繁种”的思路[7,13]。随后，邓华凤等[14]于1988年发现了水稻温敏雄性不育系‘安农S-1’(AnS-1)，表现为高温雄性不育，低温雄性可育。基于光/温敏基因能够调控雄性育性的转化特性，逐渐形成了以光/温敏感雄性不育为主的环境敏感核雄性不育为基础的两系杂交水稻育种技术，是继三系法杂交水稻成功以后又一个水稻杂种优势利用的有效途径，开启了两系杂交水稻育种时代。

2 水稻环境敏感雄性不育的分子调控机理

目前，在水稻中发现了几十个环境敏感雄性不育基因，但是只克隆了13个(表1)，大部分未被克隆(表2)。对它们的分子调控机理进行研究发现，它们涉及了转录调节、RNA代谢、氨基酸代谢、信号转导和花粉壁合成等过程。

表1 已经克隆的水稻环境敏感型雄性不育基因Table 1 The cloned environment-sensitive genic male sterility genes in rice

表2 水稻中未克隆的环境敏感型雄性不育基因Table 2 The un-cloned environment-sensitive genic male sterility genes in rice

2.1 转录调节过程

在水稻中，发现了2个MYB转录因子调节光敏雄性不育和1个PHD转录因子调节温敏雄性不育。突变体csa(Carbon starved anther)为反光敏雄性不育，在短日照条件下雄性不育，在长日照下雄性可育[19]；而CSA的同源基因CSA2突变后则表现为光敏雄性不育，在长日照表现为半不育，而短日照表现为完全可育[20]。CSA编码R2R3 MYB转录因子，调控单糖转运体基因OsMST8表达[43]；CSA2也同样编码R2R3 MYB转录因子，但是并不直接调控OsMST8，可能调控其他糖类转运基因[20]。在短日照条件下，CSA突变后导致OsMST8转录下调，不能将糖从剑叶运输到花药而导致雄性不育[19]；同样，在长日照条件下，csa2突变体不能将糖从剑叶运输到花药而导致雄性半不育[20]。这些结果表明，CSA和CSA2既有通过调节糖转运基因响应光周期影响花粉发育的共同特点，也存在不同的表达模式和靶基因的功能分化。它们调控的下游底物及相互关系仍需进一步研究。

水稻温敏不育系‘衡农S-1’的不育基因tms9-1的候选基因编码1个PHD-finger转录因子，该基因为拟南芥MS1的同源基因[18]。tms9-1的1个碱基T到C的置换导致氨基酸从L变成了P，命名为OsMS1wenmin1。OsMS1wenmin1受到温度的调控，并且温度依赖与TDR转录因子互作调控EAT1的表达，从而调控水稻温敏雄性不育[44]。

2.2 RNA代谢过程

在水稻中发现了一些非编码RNA调节光温敏雄性不育和RNA加工过程调节温敏雄性不育。NK58S是第1个在水稻中发现的光敏雄性不育系，其遗传机理较为复杂，NK58S的花粉育性主要受光照调控，而将不育基因转到籼稻品种‘培矮64S’(PA64S)中，其育性却主要受温度调控[23]。实际上，NK58S也受温度影响，光温之间有互补效应，更高的温度能够缩短育性转换成不育所需的光照时间，而更低温则延长育性转化成不育所需的光照时间[45]。NK58S的光温敏不育特性至少由3个基因(pms1、pms2和pms3)调控[12,46-47]，经过多代科学家30多年的努力，张启发院士团队和庄楚雄教授团队同时独立克隆了NK58S的pms3和PA64S的p/tms12-1，发现p/tms12-1与pms3是同1个基因[12,23]。张启发院士团队利用NK58S进行精细定位发现NK58S的pms3座位产生了C到G的1个SNP变异，位于1个长链非编码RNA(Long noncoding RNA，lncRNA)中，并将这个lncRNA命名为LDMAR(Long-day-specific male-fertility-associated RNA)[22](图1A)。较高的LDMAR表达量是维持长日照条件下花粉正常发育必需的，而C到G的SNP改变了LDMAR二级结构，提高了LDMAR启动子的甲基化程度，减少了LDMAR的表达量，导致NK58S在长日照条件下花粉败育[22]。我们认为p/tms12-1编码的lncRNA被加工成一系列的21-nt的phasiRNA(Phased small interfering RNAs)，其中phasiRNA osa-smR5864的第11个碱基由C突变成G可能会弱化其功能或产生新的功能，从而导致粳稻的光敏雄性不育和籼稻的温敏雄性不育[23](图1A)。

图1 非编码RNA调控水稻光敏雄性不育示意图Fig. 1 Schematic of non-coding RNA regulating environment-sensitive genic male sterility in rice

除了pms3基因外，光敏雄性不育基因pms1也相继被克隆，该基因发生了1个G到A的单碱基突变，与pms3相似，是1个编码lncRNAPMS1T的半显性基因。lncRNAPMS1T能够被22-nt的miR2118靶向，触发21-nt phasiRNA生物合成(图1B)。small RNA测序表明，有18对21-nt的phasiRNAs来源于PMS1T转录本。长日照条件下，NK58S花粉母细胞中21-ntPMS1T-phasiRNAs的表达量高于短日照条件下的，也高于长日照和短日照条件下重组自交系近等基因系群体的。这可能是由于在NK58S中，PMS1T从G到A的改变导致编码的lncRNA二级结构发生改变，在长日照条件下能够被miR2118更加有效地切割，产生更多的21-nt phasiRNAs，进而靶向下游的雄性不育基因[21](图1B)。虽然光温敏不育基因pms1和pms3(p/tms12-1)已经被克隆，然而pms2尚未被克隆，而且它们如何调控靶基因影响花粉母细胞和绒毡层发育，以及它们之间是否存在相互调控尚未清楚。

庄楚雄教授团队和曹晓风院士团队合作利用AnS-1和‘株1S’克隆了两系杂交水稻中运用最为广泛的温敏核雄性不育基因tms5[16]。AnS-1是最早发现的籼型温敏不育系，在低温(＜24 ℃)下表现为雄性可育，高温(＞26 ℃)表现为雄性败育，其温敏特性由单个隐性基因tms5控制，该基因编码区第71位碱基由C突变成A，导致翻译提前终止[16](图2)。TMS5基因编码1个RNase ZS1酶，对受高温诱导表达的泛素-核糖体L40家族(UbL40)mRNA具有直接而特异的切割活性，而且RNase ZS1切割UbL40mRNA依赖于底物的三叶草结构[16,48]。UbL40mRNA表达受温度诱导，高温条件下，AnS-1由于T M S 5功能缺失而不能及时切割降解U bL 4 0mRNA，导致UbL40mRNA过度积累，引发花粉母细胞液泡化，最终导致花粉败育(图2)。在野生型水稻‘安农’(A N)中，受温度诱导的U bL 4 0mRNA能够被TMS5及时降解而维持花粉正常发育。在低温条件下，AnS-1和AN的UbL40mRNA表达量较低且相当，因此无论是否存在有功能的TMS5，其花粉育性均正常[16](图2)。通过免疫共沉淀(Co-IP)/质谱鉴定，我们发现7个已知的控制花粉发育的蛋白可能被泛素化[49]，暗示UbL40可能影响花粉发育过程中的泛素平衡。同时翻译组学表明，花粉发育过程的绒毡层细胞程序性死亡和脂质代谢存在转录和翻译水平的差异，进而影响温敏不育系的花粉发育过程[50]。这说明TMS5可能通过转录、翻译和翻译后多个水平调控水稻温敏雄性不育。此外，利用CSRISPR/Cas9技术将水稻或玉米的TMS5(ZmTMS5)敲除，都能获得相应的温敏雄性不育系，这说明TMS5在禾本科植物中可能具有保守的功能[51-52]。

图2 tms5调控水稻温敏雄性不育Fig. 2 tms5 regulates thermo-sensitive genic male sterility in rice

在水稻中过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶1基因(UDP-glucose pyrophosphorylase1，Ugp1)得到1个Ugp1共抑制突变体，表现为温敏雄性不育：在低温(21 ℃)下表现为雄性可育，而高温(28 ℃)下为雄性不育[15]。在高温条件下，在减数分裂早期，该突变体花粉母细胞开始降解，而绒毡层和中层降解受到抑制。Ugp1的过量表达由玉米Ubi1启动子驱动，该启动子包含了Ubi1的第1个外显子和第1个内含子。高温下，过表达Ugp1的转录本中上述内含子不能被准确切除，导致共抑制；低温下，部分转录本中的上述内含子可以被准确剪切，导致有少量的蛋白质被翻译，育性部分恢复[15]。

2.3 信号转导过程

编码富含亮氨酸重复受体样激酶(Leucine-rich repeat receptor-like kinase，LRR-RLK)基因TMS10在水稻突变后表现为温敏雄性不育，在高温(25～32 ℃)下表现为雄性不育，在低温条件(22～24 ℃)下为雄性可育[17]。其同源基因TMS10L突变在高温和低温育性均正常，但是tms10tms10l双突变无论在高温还是低温下均为雄性不育，这说明两者存在功能冗余。而且，TMS10L的表达量在低温下是高温的3～5倍，说明它在低温中是十分重要的，能够互补TMS10的功能，从而恢复tms10突变体在低温下的花粉育性[17]。

2.4 花粉壁合成过程

植物花粉壁的合成受到一系列精细的调控，对于维持花粉活性、雌雄配子识别和花粉管萌发等过程具有重要意义。OsTMS18编码葡萄糖-甲醇-胆碱(GMC)氧化还原酶，直接受OsMS188调控，合成孢粉素以形成花粉壁[24]。OsTMS18的Gly到Ser的点突变表现出温敏雄性不育表型。然而在水稻中敲除OsTMS18使其功能丧失则导致低温和高温下都完全雄性不育，但在拟南芥中敲除其同源基因OsTMS18则是温敏雄性不育表型，这表明OsTMS18在水稻和拟南芥中的功能具有一定的保守性，但是其雄性育性也受遗传背景的调控[24]。

高等植物受精过程需要花粉粒吸附在柱头并产生水合作用，进而花粉管萌发将精子送至胚囊中，与卵子和中央细胞结合完成受精过程。目前在水稻中发现了许多湿敏雄性不育基因，如OXIDOSQUALENE CYCLASES(OsOSC12/OsPTS1)、HUMIDITY-SENSITIVE GENIC MALE STERILITY 1(HMS1)、HMS1-INTERACTING PROTEIN(HMS1I)和OsCER1/OsGL1-4[11,25-26,53]。这些基因缺失导致湿敏雄性不育表型，即高湿表现为雄性不育而低湿条件育性恢复。OsOSC12编码氧化鲨烯环化酶，能够将氧化鲨烯催化成禾谷绒毡醇，主要在花粉发育后期特异性表达，该基因的突变导致特长链脂肪酸(Very-long-chain fatty acids，VLCFAs)合成受限，花粉外壁缺陷，在低湿时容易缺水而雄性不育，高湿不易缺水而雄性可育[25](图3)。我们克隆了水稻湿敏雄性不育基因HMS1，其编码β-酮脂酰辅酶A合成酶(β-ketoacyl-CoA synthase)，在内质网中与HMS1I相互作用催化特长链脂肪酸的合成，合成产物随后被OsCER1/OsGL1-4催化形成特长链烷烃[11,26]。这些特长链脂肪酸和烷烃的缺少都会影响花粉外被的形成；在低湿条件下，缺陷的花粉壁导致花粉保水能力降低，以极快的速度皱缩，失去活性，进而影响花粉在柱头上的附着、水合和萌发，导致湿敏不育系不能正常结实；而高湿可以恢复湿敏不育系的大部分育性[11](图3)。此外，HMS1、HMS1I和OsCER1/OsGL1-4在拟南芥中的同源基因突变后也导致拟南芥湿敏不育，这说明湿敏不育在单子叶和双子叶植物中具有保守性。湿度敏感基因通过特长链脂肪酸的合成影响花粉壁的形成，进而影响花粉的保水能力，从而导致湿度敏感雄性不育。

图3 水稻湿敏雄性不育调控机理Fig. 3 Mechanism of humidity-sensitive genic male sterility in rice

2.5 氨基酸代谢过程

最近在水稻中发现了1种新型氮素依赖的环境敏感雄性不育。ETFβ编码1个线粒体定位的电子转运黄素蛋白β亚基，参与支链氨基酸的代谢。ETFβ结合电子并将电子转运给下游的辅酶Q氧化还原酶ETFQO，推动氧化磷酸化，参与机体供能。etfβ突变体中，减数分裂表现出明显的氮素依赖，低氮下减数分裂异常，而高氮下可以恢复育性[27]。

3 水稻环境敏感雄性不育在生产应用中存在的挑战与展望

3.1 环境敏感雄性不育的种质资源较为单一

目前虽然发现和克隆了许多环境敏感雄性不育基因，但是大部分依然未被克隆，在生产上应用的环境敏感雄性不育基因还比较少。在中国水稻两系杂交育种中，目前95%以上不育系利用的是温敏不育基因tms5，不利于发挥两系杂交水稻育种的潜力。为了解决这个问题，首先，要尽可能克隆更多的环境敏感雄性不育基因，研究清楚其调控机理，以便更好地应用于育种。其次，已知许多环境敏感雄性不育基因在不同物种中保守，可以将环境敏感雄性不育基因应用于其他作物当中。例如，在水稻中应用最为广泛的温敏雄性不育基因TMS5，可以利用近年发展的CRISPR/Cas9基因编辑技术在玉米中敲除TMS5同源基因，导致玉米也具有温敏不育表型[51]，同时使育种时间大大缩短，提高了育种效率[52]。利用基因编辑技术编辑不同物种间保守的环境敏感雄性不育基因不仅可快速获得环境敏感雄性不育系，而且还扩大了物种间环境敏感雄性不育基因种质资源，大大提高其他农作物的杂交育种潜力。

3.2 光敏雄性不育的遗传特性不稳定

两系杂交水稻最开始是利用来自NK58S的光温敏不育基因，但是其光温敏不育特性不稳定，繁殖多代后育性逐渐升高导致最后不能应用于杂交育种，大大限制了其利用[54]。因此后来两系杂交水稻逐渐利用遗传特性单一且稳定的温敏不育基因tms5[52]。从育种安全性来说，在杂交育种中使用光敏不育系是最为安全的，因为在自然条件下光周期比温度、湿度等其他环境因素更稳定。但是目前发现的光敏不育系的育性不仅仅只受光周期控制，还受到温度的影响[21]。此外，光敏不育基因在不同的遗传背景下可能会出现温敏不育表型。例如，主要受光周期调控的光敏不育系NK58S，将其光敏基因导入籼稻品种PA64S后，其不育性状却主要受温度的调控[23]。同样，光敏基因csa在粳稻‘9522’背景中表现为反光敏不育，但是在粳稻‘空育131’背景中同时表现为反光敏和温敏特性[19,55]。这种在不同遗传背景表现出不同的光温敏特性的现象说明，环境敏感雄性不育特性除了受环境敏感雄性不育基因调控外，还受到其他基因的修饰作用。今后，如果能发现纯粹的光敏不育基因，可以提高两系杂交制种的安全性。

3.3 温敏不育系的不育起点温度较高影响制种安全

不育起点温度(Critical sterility-inducing temperature)指温敏不育系从可育转变为完全败育的临界温度，是杂交制种安全的关键。相同的温敏基因在不同的品种背景中存在不同的不育起点温度，具有较高的不育起点温度会大大影响温敏不育系的制种安全，限制两系杂交育种方法的应用范围[52]。例如，水稻温敏不育系的不育起点温度偏高时，在夏季杂交制种时偶遇低温天气，温度低于不育系的不育起点温度时则会自交结实，导致制种不纯或者失败。据报道由于环境温度的波动导致两系法育种失败时有发生，多次直接经济损失超亿元，间接损失更是无法估计[56]。所以获得稳定遗传、不育起点温度较低的温敏不育系提高制种安全性，成为发展两系杂交水稻的重要任务[57]。水稻温敏不育系理想的不育起点温度为21～24 ℃，不育起点温度过低也不利于自身繁种[56,58]。然而许多水稻温敏不育系(特别是粳稻背景)具有较高的不育起点温度，大大影响制种安全甚至不能应用于生产[52]。温敏不育的不育起点温度受到多个微效基因的调控，所以微效不育基因的杂合性可能是引起不育系不育起点温度漂变的主要原因[59]。光温敏核不育系核心种子生产的过程也是微效不育基因纯合的过程，一旦微效不育基因全部纯合，不育起点温度将不再漂变[60-61]。但是目前鲜见关于不育起点温度基因克隆和分子机理研究的报道，其中的调控机理尚不清楚，所以未来需要在这方面进行深入研究，解决不育起点温度高和不稳定问题。