LncRNA HAND2-AS1靶向调控miR-106b-5p对IL-1β诱导软骨细胞损伤的影响

徐立 张旭然 张淼

骨关节炎是以关节软骨发生退行性病变为主要病理特征的关节疾病[1]。IL-6等炎性因子的异常分泌可引起炎性反应[2]。软骨细胞凋亡等还可造成细胞损伤进而促进骨关节炎进展，白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)可影响软骨细胞凋亡、关节软骨细胞基质合成，参与骨关节炎进展过程，并可用于建立骨关节炎体外细胞损伤模型[3]。长链非编码RNA(lncRNA)在骨关节炎中表达异常，且富含微小RNA(miRNA)反应元件，并可通过调节miRNA表达而参与骨关节炎发生及发展过程[4]。LncRNA HAND2-AS1在类风湿性关节炎中表达下调，并可抑制类风湿性关节炎成纤维细胞样滑膜细胞增殖[5]。但HAND2-AS1在骨关节炎发生发展过程中的作用机制尚未可知。LncBase Predicted v.2预测到miR-106b-5p与HAND2-AS1与存在互补片段。miR-106b-5p在骨关节炎中表达上调，抑制其表达可减缓骨关节炎进展[6]。因此，本研究以IL-1β诱导人正常软骨细胞C28/I2模拟骨关节炎细胞损伤过程，探讨HAND2-AS1是否可通过靶向调控miR-106b-5p的表达从而影响IL-1β诱导的软骨细胞损伤。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2020年2～6月本院收治的17例骨关节炎患者为骨关节组，男9例，女8例；年龄52～70岁，平均年龄(61.12±5.11)岁；所有患者符合骨关节炎诊断标准。同时选取交叉韧带损伤患者17例为对照组，男10例，女7例；年龄53～70岁，平均年龄(62.35±3.16)岁。2组性别比、年龄差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 材料与试剂 人正常软骨细胞C28/I2购自美国ATCC；IL-1β购自美国Sigma；DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、MTT、细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物；Trizol试剂与Lipofectamine 3000 Transfection Reagent购自美国Invitrogen；pcDNA、pcDNA-HAND2-AS1、miR-NC、miR-106b-5p mimic、anti-miR-NC、miR-106b-5p Inhibitor购自广州锐博生物；IL-6、TNF-α检测试剂盒购自上海酶联生物；反转录与SYBR Green试剂盒购自北京天根生化。

1.3 方法

1.3.1 采集血液样本：采集对照组、骨关节炎组患者空腹肘静脉血3 ml，将其置于乙二胺四乙酸抗凝管内，经3 000 r/min转速离心10 min，分离血浆后置于-80℃冰箱内保存。

1.3.2 实验处理及分组：取1×104个C28/I2细胞接种于6孔板，加入含有10 ng/ml IL-1β的培养基孵育24 h[7]，记为IL-1β组。同时将正常培养的C28/I2细胞记为对照组。细胞转染：用不含胎牛血清的细胞培养液分别稀释pcDNA、pcDNA-HAND2-AS1、anti-miR-NC、miR-106b-5p Inhibitor、pcDNA-HAND2-AS1+miR-NC、pcDNA-HAND2-AS1+miR-106b-5p mimic，用不含胎牛血清的细胞培养液稀释Lipofectamine 3 000 Transfection Reagent，转染物与转染试剂稀释液充分混匀后室温孵育20 min，然后将混合液按照每孔400 μl加入6孔板中，6 h后弃上清液，更换正常培养液后继续培养48 h。实验分组：按照上述脂质体转染法将pcDNA、pcDNA-HAND2-AS1、anti-miR-NC、miR-106b-5p Inhibitor、pcDNA-HAND2-AS1+miR-NC、pcDNA-HAND2-AS1+miR-106b-5p mimic分别转染至C28/I2细胞，转染成功后加入含有浓度为10 ng/ml IL-1β的培养基培养24 h，分别记为IL-1β+pcDNA组、IL-1β+pcDNA-HAND2-AS1组、IL-1β+anti-miR-NC组、IL-1β+miR-106b-5p Inhibitor组、IL-1β+pcDNA-HAND2-AS1+miR-NC组、IL-1β+pcDNA-HAND2-AS1+miR-106b-5p mimic组。

1.3.3 qRT-PCR检测HAND2-AS1、miR-106b-5p的表达水平：采用Trizol试剂分别提取对照组血浆、骨关节炎组血浆与各组C28/I2细胞总RNA，反转录合成cDNA，再按照正向引物0.4 μl，反向引物0.4 μl，cDNA 2 μl，SYBR Green Master Mix 10 μl，ddH2O 7.2 μl 制备PCR扩增体系。采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

1.3.4 MTT检测细胞增殖：每组3×103个C28/I2细胞接种于96孔板，各孔内添加MTT溶液20 μl，孵育4 h，弃上清，各孔内添加150 μl DMSO，避光振荡孵育5 min，应用酶标仪读取各孔吸光度值(A490 nm)，计算细胞增殖抑制率[(对照组A-实验组A)/(对照组A-空白组A)×100%]。

1.3.5 流式细胞术检测细胞凋亡率：用胰蛋白酶消化各组C28/I2细胞(5×105个/ml)，预冷PBS洗涤，加入500 μl结合缓冲液重新悬浮细胞，加入5 μl Annexin V-FITC与5 μl PI室温避光染色15 min，于1 h内上流式细胞仪分析细胞凋亡率。

1.3.6 ELISA法检测IL-6、TNF-α的水平：采用ELISA试剂盒检测各组C28/I2细胞液上清中IL-6、TNF-α的水平。

1.3.7 双荧光素酶报告实验检测HAND2-AS1与miR-106b-5p的靶向关系：采用分子克隆的方法分别将HAND2-AS1与miR-106b-5p的结合位点克隆至pGL3质粒中构建野生型载体WT-HAND2-AS1，同时将含有突变位点的HAND2-AS1片段克隆至pGL3质粒中构建突变型载体MUT-HAND2-AS1，采用脂质体转染法将WT-HAND2-AS1、MUT-HAND2-AS1分别与miR-NC或miR-106b-5p mimic共转染至C28/I2细胞，于培养箱内培养48 h后检测细胞相对荧光素酶活性。

2 结果

2.1 骨关节炎患者血浆中HAND2-AS1和miR-106b-5p的表达 骨关节炎组患者血浆中HAND2-AS1的表达量低于对照组(P<0.05)，miR-106b-5p的表达量高于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 骨关节炎患者血浆中HAND2-AS1和miR-106b-5p表达的检测

2.2 HAND2-AS1靶向调控miR-106b-5p HAND2-AS1与miR-106b-5p存在结合位点。过表达miR-106b-5p可降低WT-HAND2-AS1的荧光素酶活性(P<0.05)。表明HAND2-AS1与miR-106b-5p存在靶向调控作用。pcDNA-HAND2-AS1组miR-106b-5p表达量低于pcDNA组(P<0.05)。见图1，表2、3。

图1 HAND2-AS1和miR-106b-5p的互补序列

表2 双荧光素酶报告实验

表3 HAND2-AS1调控miR-106b-5p的表达

2.3 HAND2-AS1对IL-1β处理的软骨细胞损伤及炎性因子的影响 与con组比较，IL-1β组细胞IL-6、TNF-α的水平升高(P<0.05)，细胞增殖抑制率和凋亡率升高(P<0.05)；与IL-1β组、IL-1β+pcDNA组比较，IL-1β+pcDNA-HAND2-AS1组细胞IL-6、TNF-α的水平降低(P<0.05)，细胞增殖抑制率和凋亡率降低(P<0.05)。见图2，表4。

图2 HAND2-AS1抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡

表4 HAND2-AS1对IL-1β作用的软骨细胞损伤及炎性因子的检测

2.4 抑制miR-106b-5p对IL-1β作用的软骨细胞损伤及炎性因子的影响 与IL-1β+anti-miR-NC组比较，IL-1β+miR-106b-5p Inhibitor组细胞增殖抑制率和细胞凋亡率降低(P<0.05)，miR-1066-5p、IL-6、TNF-α的水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3，表5。

图3 抑制miR-106b-5p抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡

表5 抑制miR-106b-5p对IL-1β作用的软骨细胞损伤及炎性因子的检测

2.5 miR-106b-5p对HAND2-AS1处理的IL-1β作用的软骨细胞损伤及炎性因子的影响 与IL-1β+pcDNA-HAND2-AS1+miR-NC组比较，IL-1β+pcDNA-HAND2-AS1 +miR-106b-5p mimic组细胞增殖抑制率和细胞凋亡率升高(P<0.05)，IL-6、TNF-α的水平升高(P<0.05)。见表6，图4。

表6 miR-106b-5p可减弱HAND2-AS1对IL-1β作用的软骨细胞损伤及炎性因子的作用

图4 miR-106b-5p可减弱HAND2-AS1对IL-1β诱导的软骨细胞凋亡的抑制作用

3 讨论

LncRNA在骨关节炎中表达异常，并可调控miRNA/mRNA分子轴而参与IL-1β诱导的软骨细胞损伤过程，还可能作为骨关节炎治疗的潜在靶点[8-10]。HAND2-AS1在骨关节炎中表达下调，并可促进软骨细胞炎性反应的发生[11]。HAND2-AS1在糖尿病肾病中表达水平降低，上调其表达可减缓该疾病发展进程[12]。本研究结果显示，IL-1β诱导的软骨细胞增殖抑制率和细胞凋亡率升高，与相关文献报道结果[13]相似，提示成功诱导软骨细胞损伤模型。本研究分析显示，骨关节炎患者血浆中HAND2-AS1的表达量降低，提示HAND2-AS1过表达可促进IL-1β诱导的软骨细胞增殖及抑制细胞凋亡从而减轻细胞损伤。本研究结果显示，IL-1β诱导的软骨细胞IL-6、TNF-α的水平升高，与相关文献报道结果[14]相似，本研究显示HAND2-AS1过表达则降低IL-6、TNF-α的水平，提示HAND2-AS1过表达可抑制IL-1β诱导的软骨细胞炎性反应从而减轻细胞损伤。

miR-106b-5p在脂多糖(LPS)诱导的肾小管上皮细胞中表达上调，并可抑制细胞增殖[15]。miR-106b-5p在颞叶癫痫中表达上调，敲低其表达可促进神经细胞增殖及抑制细胞凋亡从而减轻细胞损伤[16]。miR-106b-5p在氧-葡萄糖剥夺和再灌注诱导的神经细胞中表达水平升高，抑制miR-106b-5p其表达可促进神经细胞增殖，抑制细胞凋亡，从而氧-葡萄糖剥夺和再灌注诱导的损伤[17]。本研究结果显示，骨关节炎患者血浆中miR-106b-5p的表达量升高，抑制其表达可提高软骨细胞增殖能力，抑制IL-1β诱导的细胞凋亡和炎性反应，然而上调miR-106b-5p表达可减弱HAND2-AS1过表达对IL-1β诱导软骨细胞损伤的保护作用。提示HAND2-AS1可通过靶向调控miR-106b-5p的表达而促进IL-1β诱导的软骨细胞凋亡、炎性反应从而加重细胞损伤进而参与骨关节炎发生及发展过程。

综上所述，骨关节炎患者血浆中HAND2-AS1的表达量降低，miR-106b-5p的表达量升高，HAND2-AS1过表达可通过靶向抑制miR-106b-5p的表达而促进IL-1β诱导的软骨细胞增殖及抑制细胞凋亡、炎性反应从而减轻细胞损伤，HAND2-AS1/miR-106b-5p分子轴在骨关节炎发生及发展过程中可发挥重要调控作用，并可能作为骨关节炎治疗的潜在靶点。