安吉白茶挥发性成分及关键呈香成分分析

石亚丽，白 艳，马婉君，朱 荫，王佳童，邵晨阳，严 寒，林 智,，吕海鹏,

（1.农业农村部茶树生物学与资源利用重点实验室，中国农业科学院茶叶研究所，浙江 杭州 310008；2.中国农业科学院研究生院，北京 100081；3.安吉县农业农村局，浙江 湖州 313300）

白化茶树是一类在特定环境下新梢呈现白化表型的茶树突变体，是我国重要的茶树种质资源之一。根据白化诱因，分为生态敏感型（低温敏感型和光照敏感性）、生态不敏感型、生态复合型等。根据GB/T 20354—2006《地理标志产品 安吉白茶》，安吉白茶产自浙江省安吉县现辖行政区内，以浙江省优良无性系良种“白叶一号”为原料，采用烘青绿茶的制作工艺（摊青、杀青、理条、初烘、焙干）加工而成。白叶一号属于“低温敏感型”的白化茶树品种，温度阈值为17～25 ℃，一般在每年的4月份鲜叶产生白化，出现“叶白脉绿”的现象，即叶片玉白色，叶脉翠绿色。安吉白茶是绿茶中的名优茶产品，其优异的香气品质是消费者青睐的重要因素之一，具有“嫩香持久”、“清香”等特点，且品质越好，香气持久度越好；此外，白化茶中氨基酸含量较高，茶叶加工过程中易与儿茶素等反应形成挥发性醛类等，正是安吉白茶特殊的物质组成造成了其独特的香气品质。

香气作为评价茶叶品质的一个重要指标，实质上是不同浓度和种类的挥发性成分组合的综合效果。受化合物气味阈值及呈香特性的影响，单个化合物对于茶叶整体香型的贡献度不同，从众多挥发性成分中鉴定出具有关键贡献作用的化合物至关重要。目前为止，已在茶叶中鉴定出700多种挥发性化合物，但只有少部分活性化合物影响着茶叶的整体香气特征，这些化合物对茶叶特殊香型的构成必不可少，被称为关键呈香成分。近年来，安吉白茶的研究主要集中在非挥发性成分方面，而挥发性成分仅有少量的报道，目前关于其挥发性成分组成及关键呈香成分仍缺乏系统研究；此外，指纹图谱是目前国际上公认的食品质量控制的有效手段之一，已在葡萄酒、亚麻籽油等食品中得到广泛的应用，但目前尚无安吉白茶指纹图谱的相关报道。

因此，本研究拟采用搅拌棒吸附萃取（stir bar sorptive extraction，SBSE）结合气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用技术分析20 个安吉白茶样品的挥发性成分组成，采用气相色谱-嗅闻-质谱（gas chromatography-olfactometrymass spectrometry，GC-O-MS）技术与相对气味活性值（relative odour active value，ROAV）方法鉴定安吉白茶的关键呈香成分，并尝试构建安吉白茶挥发性成分指纹图谱。本研究旨在解析安吉白茶的挥发性成分及关键呈香成分，揭示安吉白茶的香气品质的重要化学物质基础，为安吉白茶香气品质调控与质量控制等提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

安吉白茶样品共20 个，其中精品（AJBC1-5）、特级（AJBC6-10）、一级（AJBC11-15）、二级（AJBC16-20）各5 个（表1）。茶样（精品）等比例混合为标准混合茶粉作为后续的GC-O分析样品。

表1 安吉白茶样品详细信息Table 1 Detailed information of Anjibaicha samples collected in this study

无水氯化钠 上海Sigma-Aldrich公司；正构烷烃（C～C）、癸酸乙酯 北京百灵威科技有限公司；纯净水 杭州娃哈哈集团有限公司。

1.2 仪器与设备

PDMS搅拌棒（长度10 mm，厚度0.5 mm，含量24 μL）、ODP2 GC-O分析嗅闻口 德国Gerstel公司；SP200-2 T多磁力位点搅拌器 杭州米欧仪器有限公司；7890B-5977B气相色谱-质谱联用仪、HP-5ms色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 SBSE萃取

参照本实验室已建立的方法。具体步骤如下：准确称取600 mg茶粉与500 mg氯化钠加入20 mL顶空瓶中，加入10 mL沸水平衡1 min后，加入PDMS搅拌子，在磁力搅拌器上以1 200 r/min的转速搅拌萃取30 min后取出搅拌子，并用纯净水洗净搅拌子表面残留茶粉，无纺布擦干后暂存放于1.5 mL小瓶中待测。

1.3.2 热脱附、冷进样系统

热脱附系统：初始温度30 ℃，保持1 min；以100 ℃/min升温至240 ℃，并保持5 min。

冷进样系统：以液氮（99.99%）在-100 ℃下保持1 min后，以12 ℃/s升温速率至280 ℃，保持3 min。

1.3.3 GC-MS检测

色谱参数：初始温度50 ℃，保持2 min，然后以4 ℃/min的速率升温至170 ℃，保持5 min后，以10 ℃/min升温至265 ℃，保持5 min。溶剂排空模式，以高纯度氦（＞99.9%）为载体，流速1.6 mL/min。

质谱参数：电子电离源；温度220 ℃；电子能量70 eV；质量扫描范围30～600 u。

定性分析：通过NIST 2014数据库对GC-MS检测的化合物定性，依据正构烷烃测得各化合物的保留指数实验值，与数据库中理论值对比，要求两者差值在20以内。

定量分析：以癸酸乙酯作标准曲线计算各化合物含量。

1.3.4 GC-O-MS测定

升温程序同1.3.3节，嗅闻口与质谱系统1∶1分流进样，嗅闻口载气为高纯氮气，嗅闻系统进样口和传输线的温度分别设定为230 ℃和260 ℃。

6 位嗅闻小组成员均具备嗅闻经验，嗅闻强度以1～4表示，1表示强度最弱，依次增强，4为最强，至少3 位小组成员在同一时间阶段嗅闻到相似的气味感官描述。

1.3.5 ROAV分析

根据各化合物在水中的气味阈值，按下式计算化合物的ROAV：

式中：C为化合物相对于癸酸乙酯计算得到的含量/（μg/kg）；OT为化合物在水中的气味阈值/（μg/kg）。

1.4 数据处理

利用Origin 2018绘制柱状图与指纹图谱。

2 结果与分析

2.1 安吉白茶挥发性成分分析

采用GC-MS对20 个安吉白茶样品的挥发性成分进行检测，通过谱库检索、保留指数、特征离子对比，在安吉白茶中共鉴定109 种挥发性成分，按照其化学结构性质可分为11 类，包括醇类16 种、醛类13 种、酮类18 种、酯类29 种、内酯3 种、烯烃类6 种、酸类8 种、芳香族7 种、含氧杂环4 种、含氮杂环3 种、酰胺类2 种。其中含量较高的类别为醇类（3 748.33 μg/kg）、酯类（2 255.93 μg/kg）、酸类（874.81 μg/kg）、酮类（793.43 μg/kg）、醛类（566.82 μg/kg），而含氮杂环（325.88 μg/kg）、内酯（254.47 μg/kg）、含氧杂环（233.81 μg/kg）、芳香族化合物（224.82 μg/kg）、烯烃类（216.40 μg/kg）、酰胺类（57.67 μg/kg）含量相对较低（表2）。由此可见，醇类、酯类、酸类、酮类、醛类是安吉白茶中主要的挥发性成分。其中，酸类化合物在安吉白茶中含量相对较高，而不含一些特殊的含硫化合物可能是其区别于常规绿茶（例如龙井茶）的重要特点之一。

醇类中含量较高的化合物为香叶醇（2 502.80 μg/kg）、植醇（458.09 μg/kg）、芳樟醇（252.73 μg/kg）。研究表明，白叶一号新梢白化与返绿时期的差异表达基因主要参与代谢途径、次级代谢物生成等。这可能是安吉白茶特异性香气形成的前提条件。香叶醇可能是区分白化阶段与返绿阶段的关键差异化合物。芳樟醇具有-(+)-芳樟醇和-(-)-芳樟醇2 种香气品质差异较大的光学异构体，在绿茶中主要以-(+)-芳樟醇形式存在。香叶醇与芳樟醇具有相同的合成前体——香叶基焦磷酸酯。同时生物胁迫途径也可以促进此类化合物的释放，例如茶卷叶蛾侵害茶树后可促使茶叶释放芳樟醇，而茶蚜虫可促进香叶醇、芳樟醇的释放。

酯类是数量最多的一类化合物，含量仅次于醇类。其中，邻苯二甲酸二异丁酯（635.66 μg/kg）、水杨酸甲酯（291.07 μg/kg）、()-己酸-3-己烯酯（246.98 μg/kg）等含量较高。但以往研究发现白化诱导的偏黄色叶片中水杨酸甲酯的含量显著低于一般绿色叶片。其他含量较高的化合物有亚麻酸、十八酸、香叶酸、顺式茉莉酮、反式--紫罗兰酮、己醛、庚醛、茉莉酸内酯、吲哚。其中，亚麻酸是不饱和脂肪酸的氧化产物，脂肪酸氧化是产生有机酸类化合物的重要途径之一。反式--紫罗兰酮是类胡萝卜素降解的相关产物，在红茶香气与滋味的协同研究中发现，外源添加反式--紫罗兰酮可以增强茶汤的甜味，说明它对于茶叶风味品质的形成具有重要的作用。另外，己醛、庚醛也属于脂类氧化产物，由于儿茶素对羰基类化合物具有较强的清除能力，己醛等羰基化合物的含量在绿茶贮藏过程中易降低，而安吉白茶中己醛、庚醛含量较高很可能是由于其富含的氨基酸反应产生。

另外，按照鲜叶原料的质量要求，一般将安吉白茶成品茶分为4 个品质等级：精品、特级、一级、二级。理解不同等级挥发性成分的组成差异，有助于为安吉白茶的等级划分和加工品质调控等提供依据。有研究发现，白化茶挥发性成分总量显著低于普通绿色芽叶。比较4 个等级样品中挥发性成分总量发现，二级的样品挥发性成分含量高于其他等级（图1）。这可能是因为在茶树的生长过程中，随叶片成熟度增加，芽叶白化程度略有降低，即二级茶叶的白化程度可能略低于其他等级，使得其挥发性成分总量略高。由表2可知，醇类、酸类化合物的含量随样品等级降低而先增加后减少，含氮杂环类与之相反，而醛类化合物随等级降低逐级增加。醛类化合物是茶叶清香品质的主要来源，其含量的增加或与高等级安吉白茶的嫩香品质向较低等级安吉白茶样品的清香品质转变有关。由此可见，醛类化合物的含量可能与安吉白茶的品质等级变化密切相关；此外，二级样品中香叶醇的含量（1 725.14 μg/kg）明显低于其他等级（2 919.04、2 946.80、2 420.22 μg/kg），表明香叶醇含量可能与安吉白茶品质等级有一定的相关性。

表2 安吉白茶挥发性成分及含量Table 2 Contents of volatile compounds in Anjibaicha

续表2

续表2

图1 不同等级安吉白茶挥发性成分组成Fig.1 Composition of volatile components in different grades of Anjibaicha

2.2 安吉白茶香气指纹图谱的构建

综合比较安吉白茶GC-MS总离子流图各特征峰峰面积、保留时间，从全部的挥发性成分中筛选出34 个共有峰作为指纹图谱的特征峰，建立安吉白茶挥发性成分指纹图谱（图2）。由表3可知，34 种化合物主要为酯类、醇类、醛类、酸类化合物。以丰度最高的香叶醇作为参考峰，将其保留时间与峰面积设为1，以此为基础计算另外33 个化合物的相对保留时间及相对峰面积。结果表明，所有安吉白茶样品中全部共有特征峰的平均相对保留时间介于0.322 6～1.998 8之间，平均相对峰面积介于0.012 0～0.307 5之间。其中，邻苯二甲酸二异丁酯、植醇、吲哚、顺式茉莉酮、亚麻酸、()-己酸-3-己烯酯、水杨酸甲酯、十八酸、芳樟醇等是安吉白茶中共有的相对峰面积较高的特征峰。

图2 安吉白茶挥发性成分指纹图谱Fig.2 Fingerprint of volatile components in Anjibaicha

表3 安吉白茶的香气数字化特征指纹图谱Table 3 Digital characteristic fingerprint of aroma components in Anjibaicha

为验证模式图谱对各样品的代表性，计算已筛选的特征化合物峰面积占总峰面积的比例，以夹角余弦为标准计算各样本与模式图谱的相似度与相关系数。由表4可知，各样品中共有特征峰的峰面积均大于其总峰面积的75%，且20 个安吉白茶样品中，除AJBC-19、AJBC-20外，其他样品与模式图谱的相似度较高，均大于0.9，且相关系数也均大于0.9。表明该模式图谱基本符合指纹图谱的要求。安吉白茶指纹图谱的构建，有助于为今后安吉白茶产品的香气品质评价、真假甄别以及加工工艺提升等提供重要参考。

表4 安吉白茶指纹图谱的相似度计算Table 4 Fingerprint similarity calculated for Anjibaicha

2.3 安吉白茶关键呈香成分的鉴定

2.3.1 安吉白茶关键呈香成分的GC-O分析

由表5可知，经GC-O分析，共有34 种化合物被鉴定为安吉白茶的关键呈香成分。按照化合物的结构性质将其分为醇类（8 个）、醛类（7 个）、酯类（6 个）、酮类（4 个）、含氮杂环（4 个）、内酯类（2 个）、酸类（2 个）、芳香族化合物（1 个）。其中，香气强度值不小于3的化合物有()-己酸-3-己烯酯（3.20）、反式芳樟醇氧化物（呋喃型）（3.17）、壬醛（3.00）、吲哚（3.00）、邻氨基苯甲酸甲酯（3.00）、-紫罗兰酮（3.00）、反式--紫罗兰酮（3.00）。()-己酸-3-己烯酯（3.20）香气强度值最高，是绿茶中常见的香气化合物，带有果甜香，对黄山毛峰、西湖龙井茶香气形成具有重要的贡献。芳樟醇氧化物在茶叶中有4 种存在形式，可能是加工过程中由芳樟醇氧化产生，或者由其自身相关的糖苷降解产生。壬醛带有清新的、类似于黄瓜的气味，由不饱和脂肪酸——油酸、棕榈油酸氧化生成，是“清香”绿茶重要的香气化合物。吲哚随浓度变化呈现出不同的香型，高浓度时带有不愉快的气味，低浓度则具有明显的花香，它可能由色氨酸经色氨酸裂解酶氧化裂解产生，也可能是由左旋色氨酸在热解条件下转化生成。另外，-紫罗兰酮、反式--紫罗兰酮是茶叶中普遍存在的香气化合物，均属于类胡罗卜素衍生物，其中，反式--紫罗兰酮具有极低的香气阈值，或对于安吉白茶香气品质的形成具有重要的作用。

2.3.2 安吉白茶关键呈香成分的ROAV计算

ROAV一般用于评价单个化合物对于整体香气的贡献度，一般认为ROAV不小于1的化合物对于香气形成具有重要的作用，即被认定为关键呈香成分。因此，在GC-O鉴定的基础上，进一步计算34 种化合物的ROAV。由表5可知，共有16 种化合物ROAV不小于1。其中，ROAV较大的化合物为反式--紫罗兰酮、香叶醇、芳樟醇、己醛、庚醛、()-2-庚烯醛、-紫罗兰酮、()-己酸-3-己烯酯。反式--紫罗兰酮（紫罗兰香、奶香）不仅具有较高的香气强度值，还具有最高的ROAV。20 个样品的香气感官审评结果中，安吉白茶样品除基础的嫩香、清香属性外，部分样品还呈现出较明显的甜香，少数样品具有微弱的花香，且仅在二级样品中发现了花香特性。因此，可以推测反式--紫罗兰酮除可增加茶汤的甜味之外，可能还有助于形成安吉白茶的甜、花香品质。此外，在不同等级安吉白茶样品中，可能由于香气化合物之间复杂的互作效应，其呈香特性也具有一定的偏好性。由此可见，它是构成安吉白茶香气品质的重要化合物。此外，同一香气化合物在不同浓度下呈香特性可能有所不同。例如，1-辛烯-3-醇、己醛等在本研究中被嗅闻到带有青草气，可能是市场上一些安吉白茶产品稍带青气的原因，这与生产工艺密切相关；而己醛曾被鉴定为清香型铁观音清香味的主要来源，这类化合物也可能参与形成安吉白茶的清香、甜香品质。结果表明，反式--紫罗兰酮、香叶醇、芳樟醇、-紫罗兰酮等化合物由于其较低的气味阈值是多种茶叶的关键呈香成分。而GC-O与ROAV在鉴定结果上存在差异可能是因为两者基于的前体条件不同，GC-O以空气为介质，而ROAV的计算往往基于该化合物在水中的阈值。

茶叶中香气化合物组成复杂且结构各异，香型的形成不是各成分之间的简单加和，而是基于复杂的相互作用形成的。研究表明，结构或香气相似的化合物之间易发生协成或加成作用，而结构或香气性质差异大的成分之间易发生掩盖作用。由表5可知，安吉白茶关键呈香成分的气味类型可以分为果香、甜香、清香、花香、青气。其中，果香、甜香与花香或清香与青气这2 种类型的关键呈香成分之间是否存在协同效应，或甜香、青香之间是否存在掩盖作用还需要进一步研究。

表5 GC-O与ROAV鉴定的关键呈香成分Table 5 Key aroma-active compounds identified by GC-O and ROAV

3 结论

采用SBSE-GC-MS技术解析20 个代表性安吉白茶样品的挥发性成分，并建立安吉白茶的挥发性成分指纹图谱。研究表明，在安吉白茶中鉴定11 类共计109 种挥发性成分，其化学组成以醇类、酯类、酸类、酮类、醛类等成分为主；其中，香叶醇、邻苯二甲酸二异丁酯、植醇、吲哚、顺式茉莉酮、亚麻酸、()-己酸-3-己烯酯、水杨酸甲酯、十八酸、芳樟醇等是含量较高的挥发性成分；基于此建立的安吉白茶指纹图谱在大多样品中相似度与相关系数均大于0.9，表明该模式图谱是可靠的。

此外，安吉白茶的关键呈香成分以醇类、醛类、酯类为主，GC-O与ROAV两种方法同时确定了安吉白茶中的16 种香气化合物，包括反式--紫罗兰酮、香叶醇、芳樟醇、己醛、庚醛、()-2-庚烯醛等，表明这些化合物对安吉白茶嫩香、清香或甜香品质可能具有重要贡献。本研究结果丰富了安吉白茶香气品质化学的基础理论，有助于为安吉白茶香气品质的科学评价、质量等级判别以及加工品质调控等提供依据。