密闭巷道内气体爆炸致动物急性肺损伤的实验研究

翁昌梅,李冠桦,甘惠方,张东冬,张良潮,康建毅

(陆军军医大学大坪医院武器杀伤生物效应评估研究室/创伤烧伤复合伤国家重点实验室，重庆 400042)

随着城市化进程加速，液化天然气等可燃气体成为居民生活必不可少的能源，近年来我国燃气爆炸事故频繁发生，造成了巨大的生命财产损失[1-2]。可燃气体爆炸对生物的杀伤效应主要表现为爆炸时产生的高压冲击波导致原发冲击伤和热辐射所致的烧伤叠加，形成热冲复合伤，尤其是在密闭空间爆炸伤情更为严重。热冲复合伤后急性肺损伤进程加速，是导致患者早期死亡的主要原因之一[3]，因而研究热冲复合伤后急性肺损伤的特点对可燃气体爆炸事故伤员的救治至关重要。目前国内外关于爆炸后热辐射和冲击波复合致动物受伤的研究模型均不能真实地模拟密闭环境内可燃气体爆炸所致的热冲复合伤[4-6]。本实验通过在密闭巷道内引爆可燃气体甲烷模拟密闭环境内气体爆炸致动物损伤，对动物血清中肺损伤标志物进行检测，结合肺组织病理学及肺损伤评估，对密闭爆炸环境下热冲复合伤致动物急性肺损伤的特点进行分析研究，以期为进一步研究热冲复合伤后急性肺损伤机制及诊治提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康成年波尔山羊9只，雌雄不拘，6～8月龄，体质量(30.0±2.5)kg；健康成年新西兰大白兔8只，雌雄不拘，4～8月龄，体质量(2.5±0.5)kg，均由陆军军医大学大坪医院实验动物中心提供[动物生产许可证号：SCXK(渝)20170002]。本实验在中国煤炭科工集团重庆研究院有限公司大型地下巷道试验系统开展。该巷道直径3.2 m，高3.4 m，全长896.0 m，采用200 m3甲烷气体起爆，分别在距离爆炸点40 m、60 m处各布放实验羊及实验兔3只，在距离爆炸点80 m处布放实验羊3只及实验兔2只，试验巷道及动物布放见图1、2，山羊为站姿，兔为卧姿，所有动物均右侧面向爆炸点，右侧胸部剃毛。本实验已获陆军军医大学伦理委员会审批(AMUWEC20201924)，所有实验程序严格按规定执行。

图1 试验巷道及动物布放示意图

图2 实验动物布放图

1.2 主要实验试剂及仪器

晚期糖基化终末产物受体(receptor of advanced glycation endproducts,RAGE)、表面活性蛋白A(surfactant protein A,SP-A)、中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)测定试剂盒(江苏苏酶科)，正置荧光显微镜(日本Olympus,BX43)，酶标仪(美国Thermo,MK3)，冷冻离心机(美国Sigma,3-16KL)，温度传感器(西安玉林,ZLZ-HS-2)，压力传感器(美国PCB，113B21)。HE染色试剂(北京索莱宝)，戊巴比妥钠(德国Merk)，组织固定液(武汉博士德)，石蜡切片机(德国徕卡)，耗材均为国产。

1.3 实验方法

1.3.1动物血液采集及肺损伤标志物检测 实验羊分别在实验前(0 h)及伤后4 h、24 h、48 h取静脉血约5 mL，实验兔分别在实验前(0 h)及伤后24 h、48 h、72 h取静脉血约5 mL，室温静置2 h后，于4 ℃以3 000 r/min离心15 min，取上清分别检测RAGE、SP-A、NE含量，操作步骤按照ELISA试剂盒说明书进行。

1.3.2 肺组织病理学观察 伤后48 h，各组动物用3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉后放血处死，然后开胸取距离肺损伤部位3～5 cm处小块肺组织，大小为1.2 mm3，经4%多聚甲醛固定72 h后，乙醇脱水，石蜡包埋、切片(厚度为5 μm)、HE染色，显微镜下观察肺组织病理学改变。

1.3.3 动物损伤程度的医学评估 冲击伤判定方法：参考王正国[7]院士制定的冲击伤伤情的病理判定标准，根据肺部原发性冲击伤情况分为无伤(Ⅰ)、轻度(Ⅱ)、中度(Ⅲ)、重度(Ⅳ)、极重度(Ⅴ)五个等级，对动物的损伤程度以及肺损伤情况进行评估。烧伤判定方法：根据10 s积分数值来评估烧伤严重程度。烧伤分度见表1。复合损伤判定方法：参照简明损伤定级标准(2005版)，通过新的损伤严重程度评分(new injury severity score,NISS)[8-9]对动物复合损伤进行评估，其中1～9分为轻度损伤，10～15分为中度损伤，16～24分为重度损伤，25分及以上为极重度损伤。所有评分均由2名评估人员独立完成，结果由创伤医学专家进行最终审核。

表1 烧伤分度表

1.3.4 物理参数检测 各动物布放点放置温度传感器、压力传感器以测定该点温度、压力值。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 物理参数测试结果

2.1.1 冲击波超压测试结果 爆炸后，冲击波压力呈现不同的衰减规律(图3、表2)。冲击波正压持续时间长，为0.107～0.150 s;上升时间为0.078～0.084 s;超压峰值为112～163 kPa，在距离起爆点60 m后达到高峰值163 kPa。

图3 不同距离冲击波压力波形变化

表2 冲击波物理参数测定表

2.1.2 温度测定结果 爆炸后高温持续时间长，最长达16.6 s；10 s积分值为766～1 941 ℃·s;温度随着距离的增加而降低，范围为134.4～262.7 ℃，温度上升较快，下降比较平缓，见图4、表3。

图4 不同距离温度测试波形变化

表3 温度物理参数测定表

2.2 动物大体损伤及肺损伤评估

2.2.1 动物复合损伤评估 爆炸后，各动物受到冲击波及热辐射的叠加作用，伤亡情况如下：60 m处 2只羊(4#、8#)即刻死亡，80 m处1只羊(7#)即刻死亡，其余动物均受到不同程度的损伤。实验羊复合损伤NISS为24～57分，为重度至极重度损伤；实验兔复合损伤程度为轻度到极重度，NISS为6～30分，具体损伤评估结果见表4、5。

单因素方差分析显示，40 m、60 m、80 m之间实验羊NISSP值分别为：P(40 m∶60 m)=0.260,P(40 m∶80 m)=0.072,P(60 m∶80 m)=0.386，表明不同距离处羊损伤程度比较差异无统计意义。实验兔不同距离NISSP值分别为：P(40 m∶60 m)=0.037,P(40 m∶80 m)=0.791,P(60 m∶80 m)=0.791，仅40 m与 60 m处兔NISS比较差异有统计学意义。

2.2.2 动物肺损伤情况 爆炸后，各动物大体解剖肺损伤评分结果见表4、5。结果显示羊肺冲击伤程度为轻度到重度，中度肺损伤及重度肺损伤均占 22.2%，其中以5#羊及7#羊肺冲击伤最为严重；而兔肺冲击伤中极重度、重度、中度损伤均占12.5%，其中以R06#兔及R07#兔肺冲击伤最为严重。其余动物均为轻度肺损伤。叠加冲击波和热辐射，实验动物复合肺冲击伤和烧伤程度不一。5#羊肺出血严重，左肺上、中、下叶均有出血，且有肺大泡，右肺有条状性出血及弥漫性出血；R07#兔全肺均有散在的出血点，且肺组织有实变，见图5。

表4 羊损伤评估结果

表5 兔损伤评估结果

注：左图和右图分别为肺背侧面和腹侧面

2.3 血清肺损伤标志物检测

2.3.1 羊血清肺损伤标志物变化 与伤前(0 h)相比，爆炸后羊血清RAGE、SP-A及NE浓度均随时间呈上升趋势，在伤后24 h剧增，伤后48 h趋于稳定。伤后24 h、48 h血清RAGE、SP-A及NE浓度与伤前相比，差异有统计学意义(P<0.05)，见图6。

a：血清RAGE浓度；b：血清SP-A浓度；c：血清NE浓度 *：P<0.05；**：P<0.01

2.3.2 兔血清肺损伤标志物变化 兔血清RAGE浓度随时间逐渐上升，伤后48 h、72 h均显著高于伤前(P<0.05)；兔血清SP-A浓度在伤后24 h达到最高值，显著高于伤前(P<0.01)，此后恢复至伤前水平；兔血清NE浓度随时间逐渐上升，在伤后48 h、72 h显著高于伤前(P<0.05)，见图7。

a：血清RAGE浓度；b：血清SP-A浓度；c：血清NE浓度 *：P<0.05；**：P<0.01

2.4 肺组织病理学变化

羊肺组织病理学结果显示(图8)，2#羊部分肺泡腔萎陷，肺间质水肿、增厚，肺泡间隔断裂，肺间质及部分肺泡腔有渗出液、大量红细胞漏出，肺出血严重。5#羊肺泡结构明显，肺间质明显水肿、增厚，肺泡腔及肺间质有大量炎性细胞、散在红细胞浸润，表现为弥漫性出血。1#羊部分肺间隔断裂、肺泡腔融合，肺间质有散在炎性细胞及红细胞聚集，出血、水肿程度较2#、5#羊轻。

a：2#羊肺；b：5#羊肺；c：1#羊肺

兔肺组织病理学结果显示(图9)，R05#兔肺泡结构明显，肺间质显著增厚、水肿，充盈了大量炎性细胞及散在的红细胞，表现为肺水肿伴弥漫性出血。R07#兔部分肺泡腔萎陷，肺泡腔有大量的红细胞漏出，肺泡间隔略微增厚，肺出血较为严重。R02#兔大量肺泡间隔断裂，肺泡腔融合，肺泡腔有少许红细胞充盈，肺泡间隔有少量红细胞聚集。

a：R05#兔肺；b：R07#兔肺；c：R02#兔肺

3 讨论

热冲复合伤的伤情较单一的冲击伤或烧伤更为复杂，肺部是受热冲复合伤最严重的器官，热冲复合伤后急性肺损伤进展迅速，从而增加了热冲复合伤的早期病死率[10-11]。因此，模拟密闭环境内可燃气体爆炸致热冲复合伤的机理研究及其救治具有重要意义。本研究通过气体爆炸对不同距离的动物进行致伤以了解巷道内动物热冲复合伤及急性肺损伤的特点，结果显示不同距离处羊损伤程度无显著差异，因此动物生化指标检测不考虑布放距离的影响。根据冲击伤判定标准以及文献报道，肺损伤程度和冲击波超压峰值与正压持续时间密切相关，通常短时间(<0.01 s)脉冲的冲击波超压峰值为200 kPa左右即能引起轻度肺损伤,而长时间(>0.1 s)脉冲只需100 kPa的超压峰值即可导致严重肺损伤[12-13]；参考以往评估标准，如果10 s积分值超过1 315 ℃·s ，则人裸露皮肤可达Ⅱ度烧伤[14]。本实验物理参数测试结果显示，距离爆炸源40～80 m的冲击波超压峰值为112～163 kPa，持续时间为0.107～0.150 s；温度为134.4～262.7 ℃，持续时间为9.8～16.6 s，40 m处10 s积分值为1 941 ℃·s。由于本实验在密闭环境中进行，冲击波和热辐射叠加，故相同标准下动物实际的损伤可能会更严重。结合本实验物理参数测试及实验动物损伤评估结果，40～80 m处实验羊中、重度肺损伤比例为44.4%，实验兔中度及以上(中度、重度、极重度)肺损伤比例为37.5%，肺损伤较为严重。

血清中RAGE、SP-A、NE为创伤性急性肺损伤的标志物，其浓度能在一定程度上反映创伤性急性肺损伤的严重程度[10,15-16]。RAGE是一种损伤相关的分子模式受体，定位于Ⅰ型肺泡上皮细胞基底膜，被视为肺泡Ⅰ型上皮细胞损伤或肺损伤的标志物[17-18]。SP-A是肺泡表面活性物质的特异性蛋白之一，其在动物血清中的浓度可反映肺泡细胞的屏障功能[19-20]，动物血清中SP-A含量可能与肺纤维化严重程度有关[21-22]。NE是由中性粒细胞释放的一种丝氨酸蛋白酶[23]，在严重的炎症条件下，NE浓度过度升高，从而破坏内皮屏障并渗透到支气管肺泡腔，引起肺泡细胞损伤，加重肺损伤[16,24-25]。本实验测定了气体爆炸所致热冲复合伤后羊和兔血清RAGE、SP-A及NE浓度的变化情况，结果显示，伤后羊和兔血清RAGE、SP-A及NE浓度均呈上升趋势，且伤后24 h和/或48 h显著高于伤前，表明气体爆炸所致热冲复合伤后羊及兔均有不同程度急性肺损伤，与文献[10,15-16]报道一致。

本研究肺组织病理学观察发现，实验动物肺损伤主要表现为肺出血、肺水肿、肺泡间隔断裂、肺泡腔萎陷等。结合文献报道[26]，出现以上结果可能与热冲复合伤后肺发生以下病理生理变化有关：首先，冲击波导致肺泡细胞及肺毛细血管损伤，引起肺出血、肺水肿；其次，体表烧伤会引起体内免疫反应、远端肺损伤，激发炎症；同时，肺水肿本身也能引起肺部炎症反应，多重炎症叠加，导致炎性细胞及炎症因子聚集，肺泡上皮细胞、肺血管内皮细胞受损，通透性改变，炎性物质、蛋白复合物漏出，肺功能受损，肺组织缺氧、充血、水肿进一步加重。结合本研究损伤评分及肺组织病理结果，在热冲复合伤致肺损伤后，血清中RAGE、SP-A及NE浓度显著升高，提示RAGE、SP-A及NE在热冲复合伤的早期肺损伤中具有重要意义，对热冲复合伤后急性肺损伤的发病机制、机理研究以及诊治具有一定的参考作用。

综上，结合肺损伤标志物浓度变化、肺组织病理学观察及肺损伤评估分析，本实验提示在密闭巷道内引爆甲烷后动物肺损伤发生率较高，且主要为中重度肺损伤，主要表现为肺出血、肺水肿、肺泡间隔断裂等，在热冲复合伤所致的早期急性肺损伤中，动物血清中RAGE、SP-A及NE浓度均显著升高，表明血清RAGE、SP-A及NE能在一定程度上反映急性肺损伤的严重程度，可为密闭巷道内可燃气体爆炸所致热冲复合伤后急性肺损伤的特点研究及诊治提供参考依据。