叶面施硒对黑豆硒吸收转运特征及籽粒硒形态的影响

杜小平 刘乔斐 夏曾润 贺 博 卜贤盼 祁 蒙 唐德剑,* 佘婷婷

(1 安康市富硒产品研发中心/农业农村部富硒产品开发与质量控制重点实验室/富硒食品开发国家地方联合工程实验室，陕西 安康 725000；2 安康学院现代农业与生物科技学院，陕西 安康 725000)

硒是人和动物必需的微量元素之一，具有抗氧化、增强免疫力等重要功能[1-2]。中国营养学会规定成人每天硒平均需要量为50 μg，推荐摄入量为60 μg，最高摄入量为400 μg，生理需要量为40 μg[3]。研究表明，人体硒摄入量长期低于50 μg·d-1易引起生育力下降、克山病、大骨节病等一系列健康问题[4]。硒在维持人体健康中具有重要作用，但人体自身不能合成该元素，需要通过饮食获得[5]。因此，摄入食物的含硒量直接影响人体硒营养水平[6]。

中国是世界上缺硒程度最严重的国家之一[7-8]。前人研究表明，我国有72%的地区土壤硒含量低于国际公布的正常临界值(0.10 mg·kg-1)，属于缺硒或低硒地区，其中硒含量≤ 0.02 mg·kg-1的地区占29%[9]。成年人硒摄入量统计数据表明，我国除高硒区外的大部分地区，成人日硒摄入量均显著低于中国居民硒推荐摄入量(60 μg·d-1)，存在显著的硒“隐形饥饿”问题[10]。对于低硒或缺硒地区的居民，仅依靠普通饮食摄入硒远不能满足人体的正常硒需求。与有机硒相比，无机硒毒性高、吸收利用率低，直接将无机硒作为硒源具有较大的潜在风险。而经过植物富集转化的硒蛋白、硒多糖、硒核酸及硒酶等有机形态硒生物活性强，安全无副作用，是最为经济、安全、有效的补硒途径[11-12]。因此，通过外源硒强化技术提高作物可食部位硒含量，尤其是有机硒含量，是解决缺硒地区居民硒摄入量不足有效又安全的措施[13-14]。

植物硒含量因种类和品种不同而有较大差异[15-16]。研究表明，十字花科、豆科和百合科植物富集硒的能力大于禾本科、菊科和伞形科[17]。黑豆为豆科植物大豆[Glycinemax(L.)merr.]的黑色种子，富含蛋白质、脂肪酸等营养成分和花色苷、异黄酮等生物活性物质，具有较高的食用价值和药用价值，是典型的药食同源食物[18-19]。同时，黑豆是一种聚硒能力较强的作物，可作为硒尤其是有机硒的载体。通过外源硒强化技术可使黑豆成为一种理想的补硒食物[20]。由于施用于土壤中的硒容易被固定、利用率低且易带来环境污染风险，因此，本试验通过田间叶面喷施亚硒酸钠(Na2SeO3)溶液，分析不同浓度亚硒酸钠处理对黑豆各器官总硒含量、黑豆籽粒有机硒转化效率和营养品质的影响，旨在探究适宜的亚硒酸钠浓度，以期为外源硒强化生产富硒黑豆、提高人体硒的摄入量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验于2019年5月至10月在紫阳县洄水镇试验基地进行。供试土壤类型为黄棕壤，以多点取样法采集试验基地0～20 cm土层土壤，自然风干、研磨过5 mm筛后参照鲍士旦[21]的方法测定土壤基本理化性质，结果为：土壤pH值5.71，有机质含量2.45 g·kg-1，铵态氮含量5.34 mg·kg-1，速效磷含量14.28 mg·kg-1，速效钾含量169.20 mg·kg-1，总硒含量0.92 mg·kg-1，有效硒含量0.03 mg·kg-1。供试黑豆品种为安康小粒黑豆，购于安康汉阴华晔植物药业有限公司。亚硒酸钠购于国药集团化学试剂(上海)有限公司，含量≥97%。

1.2 试验设计

试验采用随机区组设计，共设置0、6、12、18和24 mg·m-2(以硒元素计)5个硒处理，分别记作CK、Se6、Se12、Se18和Se24，供试硒源为亚硒酸钠水溶液。每个处理设置3个重复，每个小区面积为6 m2(2 m×3 m)，各个小区之间设置宽度为1 m的隔离带。种植行、株距分别为35、25 cm，田间管理措施参照当地农户习惯模式。各硒处理在黑豆结荚兴盛期一次性兑水喷施，每平方米喷水45 g(CK组喷施清水做对照)，选择在无雨且光照强度较弱的时间段均匀喷施。在黑豆成熟后分小区一次性收割采样。用清水冲洗3次，蒸馏水冲洗3次，于55～60℃烘干至恒重，粉碎过60目筛后干燥保存备用。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 土壤及植物总硒含量的测定 土壤与植物总硒含量的测定采用氢化物原子荧光光谱法[22-23]。土壤样品加入9 mL混酸(HNO3-HCl-HF，体积比为6∶2∶1)于130℃预消解30 min，植物样品加入8 mL HNO3于70℃预消解30 min，再加入2 mL H2O2于130℃预消解30 min，冷却至室温后用MARS6高通量密闭微波消解系统(美国CEM公司)进行微波消解30 min，130℃赶酸至1 mL，加入5 mL 6 mol·L-1的HCl，130℃反应2 h将六价硒还原为四价硒，定容至25 mL，使用AFS-6500原子荧光光度计(北京海光仪器有限公司)测定总硒含量。

1.3.2 土壤有效硒含量的测定 参照《NY/T 3420-2019 土壤有效硒的测定 氢化物发生原子荧光光谱法》[24]测定土壤有效硒含量。

1.3.3 无机硒含量的测定 准确称取黑豆粉样品2 g(精确至0.000 1 g)于50 mL比色管中，加入15 mL 6 mol·L-1的HCl，混匀后在SHZ-C恒温振荡器(上海博讯实业有限公司)上于70℃、200 r·min-1条件下振荡浸提2 h，超声抽提30 min，沸水浴20 min，5 000 r·min-1离心15 min，取上清液。剩余溶液再加8 mL 6 mol·L-1盐酸溶液，重复离心，合并上清液定容至25 mL。取上清液用环己烷萃取，分出水相并蒸发掉大部分水后，按植物总硒检测方法测定无机硒的含量[24]。

1.3.4 有机硒含量的测定 采用差减法测定有机硒含量[25]。有机硒含量和有机硒转化率计算公式如下：

有机硒含量=总硒含量-无机硒含量；

有机硒转化率=(有机硒/总硒)×100%。

1.3.5 黑豆籽粒品质的测定 黑豆籽粒中蛋白质含量参照《GB 5009.5-2016 食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》[26]中的第一法凯氏定氮法测定；脂肪含量参照《GB 5009.6-2016 食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》[27]中的第一法索氏抽提法测定。

1.3.6 黑豆籽粒分离蛋白的提取 称取20 g黑豆粉样品，参照索氏抽提法[27]，按一定比例加入石油醚(固液比为1∶6)，获得脱脂黑豆粉。再加入200 mL去离子水(固液比为1∶10)，用30% NaOH调节pH值至8.0，40℃低速搅拌2 h，4 800 r·min-1离心20 min，残渣添加100 mL去离子水(固液比为1∶4)，用30% NaOH调节pH值至8.4，40℃低速搅拌2 h，合并上清液。用30% HCl调节pH值至4.5，4 800 r·min-1离心20 min，弃上清液，沉淀用蒸馏水洗涤3次，用30% NaOH调节pH值至7.0，真空冷冻干燥，得到黑豆分离蛋白。

1.3.7 黑豆籽粒分离蛋白硒含量和脂肪硒含量的测定 称取0.5 g(精确至0.000 1 g)分离蛋白和脂肪样品于微波消解罐中，加入8 mL HNO3于70℃预消解30 min，冷却至室温后再加入2 mL H2O2于130℃预消解30 min，置入MARS6高通量密闭微波消解系统(美国CEM公司)中微波消化。硒含量测定方法参照植物总硒含量的测定。

1.4 数据处理与分析

试验结果以平均值±标准差(means±SD)表示，采用OriginPro 2016软件进行图形绘制，SPSS 20.0软件进行统计分析，运用Duncan法进行多重比较、差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 叶面喷施亚硒酸钠对黑豆产量性状的影响

由表1可知，不同处理对黑豆单株荚数、单荚粒数、百粒质量和产量有一定影响，但各处理间黑豆单株荚数、单荚粒数和产量均无显著差异(P>0.05)。其中，Se6、Se12、Se18和Se24单株荚数较CK分别增加1.93%、10.54%、13.53%和7.73%，百粒质量较CK分别增加0.27%、0.38%、3.75%和0.43%，产量较CK分别增加2.20%、10.93%、12.66%和8.20%。表明适宜亚硒酸钠浓度处理对黑豆产量具有促进作用，但浓度过高会导致增产效果减弱。

表1 叶面喷施亚硒酸钠对黑豆产量性状的影响

2.2 叶面喷施亚硒酸钠对黑豆各器官硒含量的影响

由表2可知，与CK相比，随着亚硒酸钠喷施浓度的增加，黑豆根、茎、荚和籽粒中硒含量均显著增加(P<0.05)。叶面喷施24 mg·m-2亚硒酸钠(Se24)时，黑豆根、茎、荚和籽粒硒含量达到最高，分别较CK增加了8.74、8.37、9.85和65.21倍。在CK处理下，黑豆各器官硒含量呈现出荚>根>茎>籽粒的特点，亚硒酸钠处理后，黑豆各器官硒含量快速增加，籽粒中硒含量最高，根和荚次之。表明叶面喷施亚硒酸钠后，更大比重的硒被叶片吸收后转移至籽粒和荚中。

表2 叶面喷施亚硒酸钠对黑豆各器官硒含量的影响

2.3 叶面喷施亚硒酸钠对黑豆籽粒有机硒含量及硒转化率的影响

由图1可知，喷施亚硒酸钠后，黑豆籽粒中有机硒和无机硒含量均随喷施浓度的增加显著增加(P<0.05)。与CK相比，Se6、Se12、Se18和Se24处理黑豆籽粒有机硒含量分别显著增加15.44、21.17、25.38和29.33倍(P<0.05)，无机硒含量分别显著增加48.26、155.38、292.60和462.93倍(P<0.05)。有机硒转化率随喷施浓度的增加而降低，在施硒浓度为24 mg·m-2时达到最低，为52.43%。可见，叶面喷施亚硒酸钠(6～24 mg·m-2)可显著提高黑豆籽粒中有机硒和无机硒含量，但有机硒转化率随喷施浓度的增加而降低。

注：不同小写字母表示同一指标在不同处理间差异显著(P<0.05)。

2.4 叶面喷施亚硒酸钠对黑豆籽粒蛋白质和脂肪含量的影响

由图2可知，与CK相比，叶面喷施亚硒酸钠整体增加了黑豆籽粒蛋白质和脂肪含量，其中Se6、Se18和Se24处理的蛋白质含量较CK差异显著(P<0.05)。施硒量为24 mg·m-2时，黑豆籽粒蛋白质含量最高，达到40.08%，较CK增加了2.4个百分点。黑豆籽粒脂肪含量在亚硒酸钠处理间增加不显著。上述结果表明叶面喷施亚硒酸钠可提高黑豆籽粒蛋白质含量，但对脂肪含量影响较小。

注：不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。下同。

2.5 叶面喷施亚硒酸钠对黑豆籽粒分离蛋白和脂肪硒含量的影响

由图3可知，随着亚硒酸钠喷施浓度的增加，黑豆籽粒分离蛋白和脂肪硒含量呈增加趋势，各处理间分离蛋白硒含量差异显著(P<0.05)。喷施6～24 mg·m-2亚硒酸钠处理后，黑豆籽粒分离蛋白硒含量为0.761 6～1.890 2 mg·kg-1，较CK增加了47.36～117.35倍，分离蛋白硒含量占有机硒含量比例为69.12%～90.29%，占总硒含量比例为47.39%～62.67%；脂肪硒含量为0.006 5～0.012 5 mg·kg-1，较CK增加了1.60～3.10倍，脂肪硒含量占有机硒含量比例为0.47%～0.60%，占总硒含量比例为0.28%～0.50%。表明黑豆籽粒中的有机硒含量受分离蛋白硒含量影响较大，受脂肪硒含量影响小。

图3 叶面喷施亚硒酸钠对黑豆籽粒分离蛋白和脂肪硒含量的影响

3 讨论

3.1 叶面施硒对黑豆籽粒产量及各器官硒含量的影响

硒是生态环境中重要的微量元素，其丰缺与动植物的生长发育和健康密切相关[28]。研究表明，适量的硒可以促进植物生长，改善营养品质，减少空秕粒，提高产量，但硒浓度过高对植物有毒害作用[29-30]。高国英等[31]研究发现叶面喷施富硒营养素后小麦产量、千粒重和穗粒数分别较对照增加了3.14%～4.60%、1.01%～1.26%和0.69%～2.27%，但富硒营养素用量过大会导致增产效果减弱。赵婉伊等[32]采用大田试验探究叶面喷施不同浓度亚硒酸钠对茎瘤芥生长及产量的影响，结果表明1 mg·L-1硒处理的茎瘤芥产量较对照增加了1.80%，2.5 mg·L-1硒处理产量较对照减少了1.63%。本研究同样发现，喷施18 mg·m-2的亚硒酸钠可增加黑豆产量；当喷施24 mg·m-2的亚硒酸钠时，增产效果减弱，这可能与硒的双重功效有关。适宜的硒浓度能够清除体内过量自由基，增强抗氧化性，减缓生育后期叶片的快速衰老，维持根系在生育后期的生理活力，使植株积累更多的光合产物，从而产生增产作用；而当硒浓度较高时，硒在植物中起氧化促进剂作用，易引起植物的氧化应激，造成植物脂类过氧化物的积累而产生氧化胁迫，使增产效果减弱[33-34]。这与前人在水稻[35]、玉米[36]等作物上的研究结果一致。因此，在黑豆生产中，应注意外源硒使用量，以利于黑豆产量的提高。

硒在植物不同器官中的分布状况对探究硒对植物的影响以及植物硒累积特性具有重要意义[37]。已有研究表明，在作物不受硒毒害的浓度范围内，其对硒的吸收累积作用均随外源硒浓度的提高和生长期的延长而增加[38]。王玉荣等[39]在研究油菜硒富集特征时发现，外源硒施用浓度为0.5 mg·kg-1时，硒主要积累在根、茎等营养器官中；施硒浓度增加至5 mg·kg-1时，各器官硒含量表现为角果壳>籽粒>茎>根，籽粒与角果壳的硒含量占植株总硒的59.22%。陈金等[40]认为，硒供应充分时硒易向籽粒富集，成熟期大豆各器官硒累积量以籽粒最高，所占比例达到40%以上。本研究中，与对照相比，6 mg·m-2亚硒酸钠处理即可极大地提高黑豆各器官硒含量，且各器官硒含量随喷施浓度的增加显著升高，其中籽粒硒含量增幅最大，在24 mg·m-2亚硒酸钠处理时籽粒硒含量较对照增加了65.21倍。这一研究结果支持了前人在大豆[41]和小麦[42]方面报道的叶面喷施硒肥有利于促进硒向籽粒迁移富集的结果。

硒对动、植物的生长发育有益，但硒过量不仅对植物造成毒害，还存在严重的食品安全隐患[36]。根据刘慧等[43]制定的植物硒含量标准，硒含量在0.1～0.3 mg·kg-1范围内为富硒食品，硒含量>2 mg·kg-1时有中毒风险。本研究中，亚硒酸钠喷施浓度为6～24 mg·m-2时，籽粒硒含量为1.241 8～3.989 0 mg·kg-1，远超富硒食品0.1～0.3 mg·kg-1的目标值，存在较大的食品安全风险；在12 mg·m-2亚硒酸钠处理时，黑豆籽粒中的总硒含量达到2.168 1 mg·kg-1，已超过了中毒风险限量值，直接食用存在中毒风险。匡恩俊等[44]在黑龙江缺硒地区通过叶面喷施亚硒酸钠11.25～22.50 g·hm-2，即硒浓度为1.125～2.250 mg·m-2，发现水稻、大豆、玉米和小麦籽粒中硒含量为0.1～0.3 mg·kg-1，达到富硒食品标准。税杨等[45]研究结果表明施硒量小于4.5 mg·m-2时，小麦籽粒硒含量达到0.3 mg·kg-1。由此可见，作物籽粒硒含量与施硒量密切相关，过度追求高富硒值而增加施硒量，易造成籽粒硒含量超过安全值，甚至存在食品安全风险。对于通过叶面喷施外源硒生产富硒食品，应严格准确控制施硒量，建议施硒量为1.5～4.5 mg·m-2，并减少硒肥投入，以防止食品硒含量超标。

3.2 叶面施硒对黑豆籽粒有机硒和硒转化率的影响

有研究指出硒的毒性和生物利用度与摄入硒的化学形态和含量有关[46]。植物有机硒安全低毒且生物活性强，易于被人体吸收和利用，是人类硒营养来源的重要途径[47]。杨会芳等[48]通过叶面喷施试验发现叶面喷施硒可以显著提高番茄、胡萝卜和大蒜中全硒、无机硒和有机硒的含量，有机硒转化率随着施硒质量浓度的提高而降低，该研究结果与本试验结果有相似之处。本研究中，随着Na2SeO3施用量的增加，黑豆籽粒有机硒含量增加，而有机硒转化率降低。可能是叶面喷施Na2SeO3后，导致植物通过叶片吸收了大量的无机硒，由于植物对有机硒的转化效率有限，导致无机硒在植物体内聚集，使植物有机硒比例降低[49]。

3.3 叶面施硒对黑豆籽粒蛋白质和脂肪的影响

已有研究表明，适量施硒可影响作物中某些有机化合物的含量，从而有效改善作物品质[50]。植物作为人和动物摄入硒营养的主要来源，可以将无机硒转化为利用率更高的有机硒，且主要集中在蛋白质中[51]。Liang等[52]在研究红糯米种子不同部位蛋白质和硒含量相互作用时发现，红糯米籽粒中80%以上的硒是有机硒，且以硒蛋白的形式存在。本研究结果表明，叶面喷施亚硒酸钠整体显著增加了黑豆籽粒中蛋白质含量，但对脂肪含量增加的影响不显著。可能是由于半胱氨酸和蛋氨酸中含有硫元素，硒与硫竞争，硒元素取代硫元素与半胱氨酸和蛋氨酸结合，形成了硒代氨基酸化合物，部分或全部取代了蛋白质中游离的蛋氨酸和半胱氨酸后，硒被结合到蛋白质中，同时造成蛋白质三级结构的变化，进而对蛋白质的合成产生影响[53]；在脂肪酸合成途径中，硫元素是参与脂肪合成时的三碳单元中间体丙二酸单酰辅酶A(malonyl-CoA)的重要组成元素之一，环境中的硒元素和硫元素存在着竞争关系，硒元素会替代硫元素与酶结合，降低含硫酶活性，从而影响种子中油脂的合成，甚至降低油脂的含量[54]。本研究中，与CK相比，6～24 mg·m-2亚硒酸钠处理后，分离蛋白硒含量占有机硒含量的比例为69.12%～90.29%，脂肪硒含量占有机硒含量的比例为0.47%～0.60%，表明黑豆籽粒中有相当一部分硒与蛋白质结合，其赋存状态主要是以蛋白质结合形式存在。这与前人在大豆[55]、花生[56]、小麦[57]上的研究结果一致。

4 结论

本研究发现，叶面过量喷硒会显著提高各器官总硒含量，呈现籽粒>根≈荚>茎的特点，但易造成籽粒硒含量超过安全食用风险值。叶面喷硒整体可显著提高黑豆籽粒中有机硒和无机硒含量，但有机硒转化率随外源硒浓度的增加而降低，在24 mg·m-2亚硒酸钠处理时，有机硒转化率为52.43%，达到最低。叶面喷硒显著提高黑豆籽粒蛋白质含量和分离蛋白硒含量，对籽粒脂肪及其硒含量影响较小。黑豆籽粒中硒赋存状态主要以与蛋白质结合形式存在。本研究仅通过小区试验研究了四价硒素(亚硒酸钠)在黑豆中的吸收转运及有机硒转化效果，而关于黑豆对不同价态硒素(六价和零价)的吸收/积累及转化机制还不明确，有待进一步深入研究。