低钙胁迫对胎猪脂质代谢的影响

张卓炜，艾强云，何 洋，张 辉，李 英，郭剑英，唐兆新*

(1.华南农业大学，广州 510642; 2.云南农业大学，昆明 650500)

钙元素对于整个妊娠过程有着举足轻重的作用。在妊娠初期时，胎胚尚处于细胞分裂及脏器发育的初级阶段。此时胎儿对钙的需求量不会发生显著变化，因而不宜过多地补充钙，以免诱发高钙血症、结石及骨骼过度钙化等。但随着孕期的增长，尤其是在怀孕后期，由于胎儿的牙齿与骨骼加速钙化致使母体所需供给的钙量大幅度增加，此时钙缺乏将严重威胁到母体及胎儿的健康。当血清中的钙浓度低于正常阈值，机体便会激活破骨细胞并从钙库内抽调钙源以维持血钙浓度的稳定。但长期动用骨钙，轻则会影响神经系统和骨骼肌运动，重则可导致骨质疏松与瘫痪的发生。缺钙时钙离子通道开放受阻，进而使得肌纤维蛋白和肌凝蛋白无法作用于相应结合位点，最终导致子宫肌收缩乏力，引发难产。此外，妊娠期母体的血钙浓度还与产后出血症的发生相关。

动物的脂肪主要由脂肪酸和甘油合成而来。脂质的代谢是为日常生理活动供能的重要环节。脂质及其衍生物可参与包括体温调节、生物膜的组建、调控胰岛素敏感性、保护血管以及免疫反应等。脂肪不仅是初生仔猪重要的能量来源，并且脂肪组织本身还是一类内分泌器官，对调控诸如脂联素、抵抗素以及瘦素等物质的分泌至关重要。

基于现代养殖业技术的快速发展，猪群在提高生产效益的同时所承受的生理负荷也越发加重，导致钙磷代谢相关疾病的发生率也呈现出上升趋势。当胎猪受母体低钙胁迫影响时，对其脂质代谢过程又会产生何种影响，本文就围绕该问题的原因和机理进行探索，为相关领域的研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

本试验于广东省韶关市翁源县丰泽畜牧养殖有限公司猪场内进行。选取20头健康的7～8胎龄母猪并随机分成对照组(CON组)和低钙组(LCa组)，每组10头作生物学重复。按不同钙磷比配置日粮，对照组(钙∶磷=0.75∶0.592)，低钙组(钙∶磷=0.65∶0.513)。于妊娠第85天连续饲喂至第114天分娩。所有试验母猪的日常饲养流程均严格按照该猪场的常规饲养管理办法进行。日粮营养成分的调配遵照NRC(National Research Council, 2012)标准，饲料组成及营养水平见表1。

表1 基础日粮组成与营养水平(风干基础)Table 1 Basal diet composition and nutrient levels (air-dried basal) %

1.2 样本的采集

于母猪分娩后的1 h内，在同窝中筛选出体重位于中位数，且无明显异常的新生健康仔猪作为研究对象。前腔静脉采血收集仔猪血液后，实施麻醉采集其肝肾组织样本并置于液氮中保存备用。

1.3 主要试剂及耗材

代谢组学检测所使用的L-2-氯-苯丙氨酸(0.3 mg·mL)、甲醇、乙腈、二氯乙烷以及PBS溶液均为LC-MS级别试剂，购自美国Fisher Chemical公司；生化仪检测所使用的总胆固醇(total cholesterol, TC)、三酰甘油(triglyceride, TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)以及低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)试剂，购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；ELISA检测所使用的猪总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、瘦素(leptin, LEP)、脂联素(adiponectin, ADPN)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FAS)、抵抗素(resistin)、内脂素(visfatin)以及白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)ELISA试剂盒，购自上海酶联生物科技有限公司；荧光定量相关引物(表2)由上海生工生物工程股份有限公司合成。使用的相关试剂，购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

表2 基因引物序列Table 2 Gene primer sequences

1.4 数据分析

2 结 果

2.1 仔猪血清代谢组学检测结果

由图1和表3可见，CON组与LCa组差异代谢物的数据处理结果。其中，质控QC样本集中，各项调试标准合格。PCA分析中所有样本均位于大椭圆内(95%的置信区间)，同组样本聚类良好，不同组别间的样本聚类区分明显，证明CON组与LCa组具有明显的差异性。PLS-DA与OPLS-DA参数中与差值<0.3，>0.9，证明模型参数稳定且具备很好的预测能力。

图1 差异代谢通路分析Fig.1 Differential metabolic pathway analysis

表3 模型参数Table 3 Model parameters

由图1中可见，CON组与LCa组的差异代谢物及信号通路富集结果。包括甘油磷脂代谢、糖基磷脂酰肌醇生物合成、磷脂酰肌醇信号系统、乳糖代谢、不饱和脂肪酸生物合成、脂肪酸降解以及鞘脂代谢等。其中变化最为显著的是甘油磷脂代谢通路(glycerophospholipid metabolism)。

2.2 仔猪血清中脂类物质检测结果

由表4可见，仔猪血清中TC、TG、HDL-C以及LDL-C含量均无显著差异(>0.05)。

表4 血清中脂类物质Table 4 Lipids in serum mmol·L-1

2.3 仔猪脂质代谢指标检测结果

由表5可见，仔猪肾中脂质代谢指标的检测结果。其中，LCa组与CON组相比，FAS、resistin以及visfatin含量显著降低(<0.05)；由表6可见仔猪肝中脂质代谢指标的检测结果。其中，LCa组与CON组相比，FAS含量显著降低(<0.05)。

表5 肾脂质代谢指标Table 5 Indicators of lipid metabolism in

表6 肝中脂质代谢指标Table 6 Indicators of lipid metabolism in livers

2.4 仔猪脂质代谢相关基因检测结果

由图2可见，CON组与LCa组相比，LCa组肾中4(<001)、、1712以及4的mRNA表达量显著降低(<0.05)；由图3可见，LCa组肝中及的mRNA表达量显著降低(<0.05)。

*. P<0.05, **.P<0.01；下同*. P<0.05, **.P<0.01). The same as below图2 肾中脂质代谢相关基因Fig.2 Lipid metabolism-related genes in kidneys

图3 肝中脂质代谢相关基因Fig.3 Lipid metabolism-related genes in livers

3 讨 论

3.1 低钙胁迫对胎猪脂质代谢通路的影响

由仔猪血清代谢组学分析可见，低钙胁迫显著影响了甘油磷脂代谢通路。甘油磷脂是动物体内最常见的磷脂，由磷脂酸和不同的取代基团组成。其中，磷脂酸的合成还与糖脂代谢转化脂肪酸的过程有关。甘油磷脂不仅参与脂蛋白的分泌，同时也会影响胆汁对脂肪的消化和吸收。在该信号通路中，LCa组C00350位点上磷脂酰乙醇胺类(phosphatidylethanolamine, PE)物质增多。而PE的部分组成源于动物的肝和肾，所以推测低钙胁迫可能导致了胎猪的肝肾对甘油磷脂类物质的合成代谢出现了问题。LCa组C04230位点上磷酰脂胆碱类(lysophosphatidylcholine, LysoPC)物质增多。LysoPC是磷脂酶A水解产物，具有激活磷脂酶活性的作用，同时也是导致动脉粥样硬化的脂蛋白之一。LCa组C00416位点上磷脂酸类(lysophosphatidic acid, LysoPA)物质增多。LysoPA具有类似生长激素的作用，提示低钙胁迫可能还影响了胎猪的发育。此外，LCa组C01194位点上1-磷脂酰-D-肌醇(1-phosphatidyl-D-myo-inositol)增多，该物质与棕榈酸的合成相关。在脂肪酸生物合成及脂肪酸降解代谢途径中，确实发现了棕榈酸受低钙刺激增多。棕榈酸是脂肪酸合成中的首要脂肪酸，对动物的生长发育和脂肪蓄积有重要的影响。根据上述结果推测，低钙胁迫影响了胎猪的脂质代谢，导致甘油磷脂代谢(图4)及棕榈酸合成等途径发生变化，进而可能影响到胎猪在生长过程中有关脂肪的生成及消化代谢过程，甚至可能会扰乱其育肥期的生长发育。而部分差异代谢物的增多是因由机体对低钙胁迫刺激的代偿作用。

图4 甘油磷脂代谢通路Fig.4 Glycerophospholipid metabolic pathway

3.2 低钙胁迫对胎猪脂质代谢指标的影响

脂肪酸合成酶(FAS)是一类二聚体蛋白酶，其主要功能是可将摄入的碳水类物质转化为软脂酸。抵抗素(resistin)是来源于脂肪的一类肽激素，由免疫细胞和上皮细胞所分泌，具有降低对胰岛素敏感度的作用并会抑制脂肪细胞分化。内脂素(visfatin)是一类脂肪细胞因子，主要由内脏脂肪细胞所分泌，具有类胰岛素效应。Visfatin可降低血糖水平，促进脂肪细胞的分化以及参与免疫反应等。由结果可见，LCa组肾中FAS、Resistin和Visfatin，以及肝中FAS的含量均显著降低。一方面说明低钙胁迫影响了胎猪软脂酸(棕榈酸)的合成。而在代谢组学分析中也发现，LCa组棕榈酸的增多，证明低钙胁迫使得胎猪体内FAS含量减少致使棕榈酸总体含量降低，因而在低钙的刺激下促使胎猪吸收了更多的棕榈酸以起到代偿作用。另一方面，Resistin与Visfatin均具有类胰岛素作用，因此LCa组中此两种物质的减少也预示胎猪的糖脂代谢及蛋白质合成等出现异常。根据上述结果推测，低钙胁迫影响了胎猪体内脂质代谢相关激素的分泌，可能改变了其脂肪细胞的分化程度，且不利于对碳水类营养物质的吸收转化。

3.3 低钙胁迫对胎猪脂质代谢基因表达的影响

SCD(stearoyl-CoA desaturase)是脂肪组织和肝中重要的脂肪代谢限速酶，可将饱和脂肪酸催化转为不饱和脂肪酸，且SCD的表达与猪的肌肉脂肪组织含量有很强的关联性。LCa组肝肾组织中SCD的表达均显著降低，也证实胎猪的脂肪酸代谢过程的确受到了影响。并且，LCa组肾中FABP4(Fatty acid binding protein 4)及HSD17B12(hydroxysteroid 17-beta dehydrogenase 12)的表达也显著减少。FABP4是一类脂肪酸结合蛋白，负责承担内质网及细胞核中脂肪酸的运输与氧化反应等。HSD17B12参与脂肪酸代谢以及不饱和脂肪酸的生成过程，其表达还可影响雌激素分泌和卵泡的发育从而影响产仔数，这也有可能是猪群日后生产性能下滑的原因之一。此外，LCa组肾中ABCC4(ATP binding cassette subfamily C member 4)的表达显著降低。ABCC4参与将胆汁酸转运至血液循环的过程，从而调节对脂质及蛋白质的利用等。低密度脂蛋白是转运内源性胆固醇的重要载体，尽管仔猪血液中LDL-C的含量未发生明显变化，但在LCa组肝中LDLR的表达显著降低，说明低钙胁迫仍可能致使胎猪的胆固醇代谢障碍。根据上述结果推测，低钙胁迫影响了胎猪脂质代谢相关基因的表达，尤其是在脂肪酸的转运及代谢方面较为显著，甚至还可能会影响其今后的生产性能。

4 结 论

妊娠母猪缺钙可影响胎猪的甘油磷脂代谢、糖脂代谢及脂肪酸的生成等，对胎猪的健康造成了一定的隐患。