不同饲料对断奶兔十二指肠、空肠结构和消化酶活性影响

2022-10-28仲华玲何丛丛吴邦元

饲料博览 2022年5期

仲华玲，何丛丛，吴邦元

（1.江苏联合职业技术学院淮安生物工程分院，江苏淮安 223000；2.西华师范大学生命科学学院，四川南充 637000）

我国养兔历史悠久，兔肉有“四高四低”特点（四高即高蛋白、高赖氨酸、高卵磷脂、高消化率，四低即低脂肪、低胆固醇、低尿酸、低热量），肉兔还具有高产仔率、高幼崽成活率及高肉兔出栏率的特点，被广泛饲养[1-2]。兔肉、兔毛、兔皮、兔粪、兔尿都可被有效利用[3-4]，兔文化遗产和精彩的神话传说也给人们带来宝贵的精神财富[5]。从饲养角度看，兔子以食用草料为主，饲养成本低，回报率高，因其食草，所以其肠道中微生物种类丰富[6-8]。在小肠中，十二指肠和空肠是营养物质主要消化和吸收的场所，小肠的绒毛长度、宽度、表面积、隐窝深度的变化均会影响肠道营养吸收能力[9-10]，而绒毛长度与隐窝深度的比值（V/C值）则可以反映出小肠的功能状态[11]。

动物生存和繁衍所需的营养物质都依赖于食物，食物成分可影响动物的肠道结构[12-13]，如粗纤维（CF）能改变家兔肠道形态结构[8,14]。但是，不同饮食方式对于执行消化吸收功能的主要器官——十二指肠和空肠的结构是否有影响值得进一步探索。因此，本研究以不同饲料条件下新西兰兔为研究对象，利用组织学技术对其十二指肠和空肠形态结构进行分析，探讨两肠段在消化吸收功能上的差异，力求拓展饮食为新西兰兔肠道结构影响的研究提供参考，同时为兔子养殖产业提供理论依据。

1 材料

1.1 试验动物及试验材料

试验选用24只30 d断奶的、生长状况良好的新西兰兔，随机分为A、B两组。试验饲养期间，两组家兔在相同生长环境下喂养，均放置于试验用的笼子中。其中，试验A组仅以全价颗粒饲料饲喂，试验B组仅以苜蓿鲜草为单一日粮饲喂。同时提供充足饮水，连续饲养60 d，试验结束前一天饥饿处理1 d，于第2天剖杀取材。

1.2 日粮组成

A组采用由山东省临沂市盛泉油脂化工有限公司江泉饲料厂生产的聚鑫明牌母幼兔通用配合饲料。该饲料适用于任何日龄新西兰兔，饲喂按照我国家兔建议营养供给中颗粒饲料标准，全期每只每天平均相对饲喂量为100 g（范围60～110 g，随幼兔日龄增加而增大）这一标准。B组仅以苜蓿鲜草[15]为单一日粮饲喂，配成等能等氮的日粮。在试验中使两组幼兔平均每只每天所摄取的营养含量大致相当，且符合饲养标准，满足4～9周龄生长兔营养需求，两组日粮组成及营养水平结果见表1。

表1 试验日粮配方及营养水平

1.3 主要仪器和试剂

光学显微镜（型号为CX50），日本OLYMPUS公司产品；电热恒温水浴锅（型号为HHSY11-Ni），北京市长风仪器仪表公司产品；恒温干燥箱（型号为DHG-9124），上海昕仪仪器仪表有限公司产品；组织切片机（型号为RM2236），德国Leica公司产品；盖玻片、载玻片、镊子、烧杯等，实验室自备。

苏木素（H3136）、伊红Y（E4009），德国默克Sigma-Aldrich公司产品；二甲苯、100%乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、中性树胶、1%盐酸-乙醇等，实验室自备。

2 方法

2.1 试验取材及肠段长度和重量的测量

试验结束后，分别将24只新西兰兔处死并剖杀，其中12只立即取十二指肠和空肠组织样品，先用生理盐水清洗肠道，后放置于4%多聚甲醛中固定。

另外12只剖杀后取出十二指肠、空肠和盲肠，分别测量各肠段长度。收集各肠段内容物后放入10 mL离心管中，-20℃冰箱保存备用，用于消化酶和纤维素酶活性的测定。清除消化道中内容物后，称量各段消化道重量。

消化道相对长度=消化道长度（cm）/体长（cm）；消化道相对重量（g/kg）=消化道重（g）/活重（kg）。

2.2 十二指肠和空肠组织切片的制作与染色

固定好的组织经清水清洗后，分别放入75%、85%、95%和100%乙醇中脱水，然后放入二甲苯中透明后进行浸蜡和包埋处理，最后进行切片。

（1）切片与展片：切片厚度为5 μm，切出含有完整组织的蜡片，放入37℃恒温水浴箱中使蜡片充分延展；

（2）贴片与烤片：取干净做完标记并涂抹蛋白胶的载玻片，捞取组织，烘干进行染色；

（3）苏木精和伊红染色（Hematoxylin & eosin，H.E.）：将切好的切片经过二甲苯和乙醇脱蜡后进行染色：苏木素染液染色→水洗3～4次→显微镜观察→1%盐酸乙醇溶液→氨水→水洗2～3次→显微镜观察→伊红染液→水洗至澄清→显微镜观察，然后进行脱水和再次透明，最后封固、干燥、观察。

2.3 消化酶活性和纤维素酶活性的测定

消化酶活性的测定：剖杀后取出十二指肠及空肠中食糜，采用南京建成生物工程研究有限公司所生产的胰蛋白酶测定试剂盒（A080-2-1），按照操作说明测定十二指肠和空肠胰蛋白酶活性。

盲肠纤维素酶活力测定：羧甲基纤维素酶、水杨苷酶和木聚糖酶的酶活力的测定采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法、DNS还原糖分析法测定[16]，酶活单位（IU）的定义为每分钟每毫升酶液作用于底物生成的还原糖量（μmol）。

2.4 小肠相关指标测量

使用Olympus CX50光学显微镜分别在选取的切片上随机截取3～5张结构完整的肠道，测量绒毛高度、绒毛宽度、隐窝深度和肌层厚度等数据，同时计算绒毛高度与隐窝深度的比值以及绒毛表面积。具体测量方法见图1。

图1 小肠相关指标的测量方法

2.5 数据处理

试验数据均使用Excel 2019软件整理，以“平均数±标准差（Mean±SD）”表示，使用IBM SPSS Statistics 24软件进行数据处理，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）比较两组别之间的差异性，检验水准为α=0.05，若P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著，作图用Excel 2019软件。

3 结果与分析

3.1 不同饲料对断奶兔消化道相对长度及相对重量的影响

食草兔和食饲料兔十二指肠和空肠的相对长度和相对重均有显著差异。空肠的相对长度和相对重量，食草兔极显著高于食饲料兔（P＜0.01）；而十二指肠的相对长度和相对重量，食草兔显著高于食饲料兔（P＜0.05），见表2。

表2 不同饲料对断奶兔十二指肠、空肠的相对长度和相对重量的影响

3.2 不同饲料对断奶兔十二指肠绒毛高度、隐窝深度和肌层厚度的影响

十二指肠的绒毛高度食草兔显著高于食饲料兔（P＜0.05），而隐窝深度则是食饲料兔极显著高于食草兔（P＜0.01）；两者肌层厚度无显著差异（P＞0.05），见图2和图3。

图2 食草兔（左）和食饲料兔（右）十二指肠形态学变化情况

图3 食草兔和食饲料兔十二指肠绒毛高度、隐窝深度及肌层厚度变化情况

3.3 不同饲料对断奶兔空肠绒毛高度和隐窝深度的影响

食草兔空肠的绒毛高度和隐窝深度均显著低于食饲料兔（P＜0.05），而肌层厚度两者无显著差异（P＞0.05），见图4和图5。

图4 食草兔（左）和食饲料兔（右）空肠形态学变化情况

图5 食草兔和食饲料兔空肠绒毛高度、隐窝深度及肌层厚度变化情况

3.4 不同饲料对断奶兔十二指肠和空肠绒毛高度和隐窝深度比值的影响

十二指肠和空肠绒毛高度和隐窝深度比值均是食草兔极显著高于食饲料兔（P＜0.01），见图6。

图6 食草兔和食饲料兔十二指肠和空肠绒毛高度和隐窝深度比值

3.5 不同饲料对断奶兔十二指肠和空肠绒毛表面积的影响

食草兔十二指肠的绒毛表面积极显著大于食饲料兔（P＜0.01），而食草兔空肠的绒毛表面积高于食饲料兔，但差异不显著（P＞0.05），见图7。

图7 食草兔和食饲料兔十二指肠和空肠绒毛表面积

3.6 不同饲料对断奶兔消化酶活性的影响

饲粮不同，对兔十二指肠和空肠胰蛋白酶活性有显著影响，食草兔的十二指肠和空肠胰蛋白酶活性极显著高于食饲料兔（P＜0.01），见图8。

图8 食草兔和食饲料兔十二指肠和空肠消化酶活性变化情况

3.7 不同饲料对断奶兔盲肠纤维素酶活性的影响

食草兔和食饲料兔盲肠羧甲基纤维素酶、水杨苷酶和木聚糖酶酶活有显著差异，食草兔上述3个纤维素酶活性极显著或显著高于食饲料兔（P＜0.05或P＜0.01），见图9。可知食草兔盲肠对纤维的消化能力明显高于食饲料兔。

图9 食草兔和食饲料兔的盲肠纤维素酶活性

4 讨论

4.1 不同饲料对断奶兔十二指肠和空肠长度和重量的影响

十二指肠与空肠是消化道的重要组成部分，是机体营养物质消化吸收的主要场所。本次试验中，食草兔和食饲料兔十二指肠和空肠的相对长度和相对重量有显著差异，食草兔显著或极显著高于食饲料兔（P＜0.05或P＜0.01），产生此差异的原因可能与两种饲料中的纤维含量有关，苜蓿鲜草的纤维含量明显高于全价配合颗粒饲料。本试验结果与R.Jha等[17]、孙立侠[18]的研究结果类似，他们研究也发现纤维水平增高可使肠道长度和重量加大，因为高纤维能量密度低，导致兔采食量增大，促进消化道黏膜增生。

4.2 不同饲料对断奶兔十二指肠和空肠结构的影响

营养物质的吸收大部分在小肠中完成，十二指肠、空肠表面布有肠绒毛、隐窝等结构，肠绒毛的宽度和高度与隐窝的深度及绒毛高度与隐窝深度的比值（V/C值）可综合反映肠道消化吸收能力的强弱[19-20]。绒毛高度越高，隐窝越浅，肠道的消化吸收能力越强。本试验结果发现食草兔十二指肠的绒毛高度与绒毛表面积显著高于食饲料兔，空肠的绒毛表面积也高于食饲料兔。有研究发现，随着日粮纤维水平的提高，可以增加吉林白鹅肠道绒毛高度，提高消化吸收效率，促进肠道发育[18]，这与本试验研究结果相似。但也有研究发现，日粮中性洗涤纤维水平对3～5月龄獭兔十二指肠、空肠的绒毛高度与隐窝深度均无显著影响，但其含量增高，将促进肠道蠕动，提高消化吸收功能[21]。隐窝是小肠的上皮下陷至固有层而形成的指套状结构[15]，隐窝深度表示肠腺到黏膜表面的距离，它反映出肠道内细胞产率，隐窝深度变浅表明基部细胞生成率降低，上皮细胞成熟率升高，营养物质吸收能力增强。有研究发现十二指肠隐窝深度随纤维水平的升高出现逐渐变小的趋势，高纤维水平刺激上皮细胞成熟，使肠道对营养物质吸收能力增强[12,22]。本试验结果也发现食饲料兔十二指肠隐窝深度极显著高于食草兔，食饲料兔空肠的隐窝深度极显著高于食草兔，与上述研究结果一致。结果表明无论在十二指肠或是在空肠中，食苜蓿鲜草兔组小肠上皮细胞发育均较为完善，也表明十二指肠和空肠对苜蓿鲜草中营养物质的消化吸收能力更强。

4.3 不同饲料对断奶兔的消化酶和纤维素酶活性的影响

消化酶活性是反映动物生产性能及消化率高低的重要指标之一，消化酶负责催化体内糖、脂肪和蛋白质水解，对动物体内营养物质的吸收和利用极为重要。消化酶活性的提高，可促进机体消化系统对营养成分的消化吸收，提高消化效率，促进动物生长；其活性降低，则效果相反。兔的纤维消化主要依赖于盲肠中微生物分泌的纤维素酶，主要包含羧甲基纤维素酶、水杨苷酶和木聚糖酶等，其水平综合反映盲肠微生物分解和消化纤维素与半纤维素的能力[23-24]。在本试验中，食草兔的十二指肠和空肠胰蛋白酶与纤维素酶活性均显著高于食饲料兔，推测纤维素的增加可提高肠道中胰蛋白酶与纤维素酶活性。研究发现饲粮中添加适量的苜蓿草粉可以提高仔猪胰蛋白酶的生物学活性[25]。与之类似的研究也发现饲料中纤维含量的增加，可增加兔盲肠内的纤维素酶活性，增强盲肠对纤维素的消化吸收[26]。本次试验结果与上述人员研究结果类似，食草兔盲肠羧甲基纤维素酶、水杨苷酶和木聚糖酶活显著高于食饲料兔，这可能是因为家兔本身不能分泌纤维素酶，但家兔盲肠中存在大量的微生物，它们可不断产生纤维素分解酶，降解草中的纤维，这三种消化酶活性的升高可促进肠道内有益菌群的增殖，进一步促进食草兔对草食纤维的消化利用。纤维素酶的活性增加，推测与盲肠中的分泌纤维素酶的微生物有关，纤维可以被盲肠微生物分解成脂肪酸，脂肪酸可作为微生物的能量来源，增加盲肠内与纤维分解相关微生物的数量，导致纤维素酶活性相对提高[27]。