现地应用鸡红细胞保存方法的研究

李 鑫，方 超，李建华

（1.黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2.哈药集团生物疫苗有限公司，哈尔滨 150069）

在动物血清抗体监测过程中，常进行血凝-血凝抑制试验，如新城疫病毒抗体、禽流感病毒抗体、减蛋综合征病毒抗体等，均需要新鲜的1%鸡红细胞作为材料辅助进行试验。但新鲜鸡红细胞的制备需要特定环境（无病毒感染）下的SPF大公鸡，且保存期较短，配制繁琐，所以使用方便和稳定的鸡红细胞保存方法是必然的需求。本研究通过借鉴相关研究制备了醛化鸡红细胞、冻干鸡红细胞，并与1%新鲜的鸡红细胞进行了对比试验，以期为适用于现地实际应用提供理论依据。

1 材料

磷酸缓冲盐溶液（PBS），购自Biosharp公司，按说明书添加双蒸水，调节pH值为7.2～7.4；2.5%戊二醛溶液（C5H8O2），购自中国医药（集团）上海化学试剂公司；血凝-血凝抑制用新城疫病毒标准抗原/抗体、血凝-血凝抑制用禽流感H9病毒标准抗原/抗体，均为哈药集团生物疫苗有限公司制备。

2 方法

2.1 新鲜鸡红细胞的制备

参照杨志峰[1]制备鸡红细胞的方法，选择12个月以上的SPF公鸡，翅下静脉无菌采集血液至抗凝管中，低速（3 000 r·min-1）离心5 min，去除上层液，留取下层鸡红细胞，用PBS液洗涤，再离心，去上清，重复2次。最后，采用PBS重悬鸡红细胞，配制成10%的鸡红细胞悬液，置于4℃冰箱中保存。

2.2 1%鸡红细胞的制备

取新鲜配制的10%鸡红细胞，1 500 r·min-1离心5 min，参考王宇波等[2]的方法，按血细胞比容用pH为7.2～7.4的PBS液重悬，得到1%鸡红细胞，放置于4℃冰箱中保存备用。

2.3 醛化红细胞的制备

根据万勇虎等[3]、孙军杰等[4]试验结果，确定醛化红细胞的制备方案。将鸡红细胞缓慢加入2.5%戊二醛溶液中，配制成1%红细胞悬液，在4℃条件下醛化5 h，放置于4℃冰箱保存备用。

2.4 冻干红细胞的制备

曾丽亚[5]在《诊断用冻干鸡红细胞的制备》研究中，制定了适合红细胞冻干的条件：将醛化后红细胞悬液置于液氮气相中平衡30 min，冻干体系达到超冷状态但未出现结冰，再置于冷冻干燥机中抽真空，冻干时间设置为20 h，冻干隔板温度为-35℃，最后将西林瓶压盖、封装。取冻型完整、颜色均匀和空隙致密的冻干红细胞，放置于-20℃冰箱中保存备用。

2.5 微量血凝-血凝抑制试验

设2个试验组，分别为醛化红细胞试验组、冻干红细胞试验组，以及对照组（1%新鲜鸡红细胞），见表1。以上各组同时进行新城疫病毒和禽流感H9病毒的微量血凝-血凝抑制比较试验，具体步骤参照康华玲等[6]、黄艳羚等[7]的试验方法。

表1 试验分组

2.6 现地临床血清样本检测

随机无菌采集取某鸡场现地鸡血10份，进行3 500 r·min-1离心5 min，分离血清，分别使用2.5%醛化红细胞、2%冻干红细胞、1%新鲜鸡红细胞进行新城疫病毒抗体和禽流感H9病毒抗体检测，观察各试验组的差异。

3 结果与分析

3.1 新城疫病毒血凝-血凝抑制试验（NDV HAHI）

通过新城疫病毒血凝-血凝抑制试验，重复3次同时比较试验，取平均值（保留整数），可以看出：对照组与试验组1和试验组2存在明显差异。在血凝试验中，对照组较试验组1和试验组2的血凝价均高，且试验组1比对照组低2个效价、试验组2比对照组低3个效价，具体见表2；在血凝抑制试验中，试验组1比对照组的新城疫血凝抑制价

高1个效价，试验组2比对照组的血凝抑制价高2个效价。通过重复试验比较可知，试验组1和试验组2与对照组的血凝价-血凝抑制价差异稳定，具体见表2、表3。

表2 新城疫病毒血凝试验结果

表3 新城疫病毒血凝抑制试验结果

3.2 禽流感H9病毒血凝-血凝抑制试验（AIVH9 HA-HI）

通过禽流感H9病毒血凝-血凝抑制试验，重复3次同时比较试验，取平均值（保留整数），在血凝试验中，对照组较试验组1、试验组2的血凝价均高，且试验组1比对照组低1个效价、试验组2比对照组低2个效价，具体见表4；在血凝抑制试验中，试验组1比对照组禽流感血凝抑制价高1个效价，试验组2比对照组血凝抑制价高2个效价，具体见表5。可看出，对照组与试验组仍存在明显差异。重复试验可以看出，差异存在是稳定的。

表4 禽流感H9病毒血凝试验结果

表5 禽流感H9病毒血凝抑制试验结果

3.3 现地临床样本检测

在某鸡场现地采集的血液，分离得到血清约0.75 mL·只-1，使用不同红细胞悬液，各重复3次。新城疫、禽流感H9的血凝抑制试验中，使用2.5%醛化红细胞、2%冻干红细胞的抗体效价结果均高于1%新鲜鸡红细胞（分别为8.2 lb、9.7 lb和7.4 lb；7.0 lb、8.0 lb和6.3 lb；），且符合试验组中两者之间的抗体差异规律。详细结果见表6。

表6 现地临床样本血清检测结果lb

4 分析与讨论

禽类抗体监测是养殖业的重点项目，从抗体检测结果中可以得到禽类的免疫情况及有无潜在的疫病存在。禽类抗体检测通常在实验室采用琼括试验、间接酶联免疫吸附试验、微量血凝抑制试验等进行，但在现地抗体临检通常采用微量血凝-血凝抑制试验，试验中需要新鲜的鸡红细胞，但新鲜鸡红细胞制备需要离心机、SPF大公鸡等条件，现场制备麻烦，因此这成为限制临床检测禽类血清样本的因素[8]。通过醛化红细胞和冻干红细胞替代新鲜鸡红细胞进行检测，可为现地临床试验提供便利。

通过2.5%醛化红细胞（试验组1）、2%冻干红细胞（试验组2）与1%新鲜鸡红细胞（对照组）比较试验发现，在新城疫病毒血凝试验中，试验组1与对照组比低2个效价，试验组2与对照组比低3个效价；而在禽流感-H9病毒血凝试验中，试验组1较对照组低1个效价，试验组2较比照组低2个效价。在新城疫血凝抑制试验中，试验组1较对照组高1个效价，试验组2较对照组高2个效价；在禽流感-H9病毒血凝抑制试验中，试验组1较对照组高1个效价，试验组2较对照组高2个效价。3组之间的差异存在着一定的规律性[9]。

有报道表明，2.5%戊二醛可改变红细胞表面受体结构，从而使红细胞的血凝活性发生改变[10]，所以醛化的鸡红细胞与新鲜的鸡红细胞的血凝价等存在一定差异。新鲜的鸡红细胞保存期短，仅能维持5 d左右，之后会发生红细胞破裂，但由于戊二醛存在2个具有反应活性的醛基，可与新鲜红细胞上的自由氨基或者巯基结合，从而增加了红细胞的机械强度，不容易发生破碎，延长了红细胞的保存期[11]。

冻干红细胞是通过醛化后的鸡红细胞冷冻真空干燥制备而成，冻干红细胞加水复原后，细胞形态完整，仍可进行血凝-血凝抑制试验，原则上血凝价与醛化后的鸡红细胞相同，但在冻干前分装或操作不当均会造成红细胞的破坏，所以在血凝-血凝抑制试验中，醛化的鸡红细胞与冷冻真空干燥的鸡红细胞存在1～2个效价差。醛化的鸡红细胞保存时间大概为3个月以上[12]，而冻干红细胞在4℃条件下可维持半年以上[13]。

通过现地临床检测鸡的新城疫病毒、禽流感H9病毒抗体情况，可以看出醛化红细胞、冻干红细胞与新鲜的鸡红细胞的抗体效价之间的差异是稳定存在的，且醛化红细胞与新鲜鸡红细胞及冻干红细胞与新鲜红细胞之间的差值也是相对稳定的。所以，在现地进行血凝-血凝抑制试验，可应用醛化红细胞或冻干红细胞来代替1%新鲜鸡红细胞。

新鲜的鸡红细胞制备简单，但在4℃条件下保存期仅为5 d左右，醛化的红细胞保存期所有延长，但两者在现地检测中，存在运输问题，若路途颠簸，可能造成红细胞的二次破裂，影响试验结果。而冻干鸡红细胞形态稳定，不易再受外界影响破坏红细胞，对结果影响较小。综上所述，在现地进行血凝-血凝抑制试验时可使用2%冻干鸡红细胞来代替1%新鲜鸡红细胞。