液相色谱-质谱法在食品农药残留分析中的应用

彭 莉，杨文凡

(昆明冶金高等专科学校 环境与化工学院，云南 昆明 650000)

近年来，由于全球化和新技术的发展，农业食品部门正在经历根本性的变化，此外，消费者关心他们所吃的食物，并要求对他们所消费的产品质量、安全性和地理来源有更多的保证[1-3]。食品中农药残留的控制是保证人类食品安全、保障消费者健康的本质要求。农药残留问题也引起了越来越多的国家的高度重视，美国早在上世纪60年代就由美国环保局(EPA)开始实施农药残留容许量标准的制定与落实[4]，并不断加以完善，目前已经构建了较为齐全的农药残留标准容许量与残留容许量豁免规范体系；在欧洲，欧洲议会理事会关于农药残留的第396/2005号法规(EC)规定了拟供人类食用的动植物产品中允许的农药最大残留限量(MRL)[5]。我国《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》规定了超过400种农药在300多种食物中的残留限值。

气相色谱-质谱联用(GC-MS，GC-MS/MS)和电喷雾电离液相色谱-串联质谱联用(LC-MS/MS)是食品中多残留农药分析最常用的技术，因为它们具有较高的灵敏度和选择性，能够在一次运行中以非常复杂的矩阵从各种化学类别中筛选多种农药。前者仅可用于挥发性化学品的分析；因此，所分析的农药必须是挥发性的或易于衍生的，以确保其挥发性。GC-MS是低极性农药的首选方法；对于更多极性化合物则采用LC-MS更为适合。选择LC-MS/MS而非GC-MS的主要原因之一是需要处理更多的极性农药以及农药代谢物，这些代谢物通常比农药本身更具极性且挥发性更小，通过LC-MS可以分析比GC-MS范围更广的化学品。大量的对GC-MS(/MS)和LC-MS/MS测定农药能力进行的评估研究表明，LC-MS可实现更宽的范围和更好的灵敏度。

1 单仪器分析方法概述

1.1 液相色谱法

用于测定食品中较高浓度的农药残留可以采用HPLC技术，使用梯度洗脱，有机溶剂百分比线性增加。等度洗脱偶尔使用。梯度洗脱的优点是可以通过降低流动相的极性达到最佳分离条件。这导致洗脱强度增加，疏水物质从柱中洗脱，疏水物质与固定相强烈相互作用。亲水分子首先离开色谱柱，然后是极性较低的分子，最后是疏水分子。使用不同体积比的乙腈、甲醇和水的混合物作为洗脱液。通过向流动相中添加有机酸(甲酸或乙酸)、铵盐(甲酸铵或乙酸铵)或有机酸与其铵盐的组合，可进一步提高分离效率[6]。

1.2 质谱法

质谱是一种关键的分析技术，能够识别各种化合物，包括农药。无论其结构和指定用途如何，质谱仪都会测量带电分子的质量荷电比。每台质谱仪由三个基本部件组成：一个离子源，一个根据离子的质荷比分离离子的分析仪，以及一个离子计数的检测器。多个分析仪的串联连接是系统最常见的修改[7]。质谱仪的分析仪和检测器保持在高真空中，以避免与空气分子发生意外碰撞。

1.3 电离法

电离物质的可能性是质谱仪分析物质的基本条件。电离方法因电离器的结构和工作原理而异。电喷雾电离(ESI)和大气压化学电离(APCI)是通过LC-MS系统测定食品中农药残留最常用的电离方法。这2种方法都基于大气压电离(API)，能够将大量从色谱柱流出的溶液引入质谱仪，而不会失去高真空。电喷雾电离和大气压化学电离都可以在两种操作模式下进行分析：即产生正离子模式和产生负离子模式[8]。

2 串联质谱法

串联质谱(MS/MS)是由两个相同类型或不同类型的组合分析仪组成的系统，其特点是分离效率高。源产生的前体离子在第一台分析仪(MS1)中分离。具有所选m/z值的离子到达碰撞单元，在碰撞单元中，根据分析条件，它们发生离解或保持不变。由于离子离解(称为碎裂)，产物离子在第二台分析仪(MS2)中根据m/z参数的数值生成和分析。与使用单个分析仪的分析相比，串联分析通过提高选择性和显著增加灵敏度，大大改善了分析条件。连接不同类型的分析仪有多种可能性。三重四极杆系统(QQQ)、四极杆-飞行时间系统(Q-TOF)和四极杆线性离子阱系统(Q-trap)是串联质谱法中用于测定食品中农药残留的最常用的分析仪组合。

2.1 三重四极串联质谱法

三重四极杆(QQQ)是最流行的串联质谱仪之一，其中两个四极杆作为离子分析器，中间的第三个四极杆作为碰撞单元。只有具有特定m/z值的离子，即所谓的前体离子，才能通过第一个四极杆。然后，这些前体离子在第二个四极杆(用作充满惰性气体的碰撞池)中发生碎裂。检测器记录碎片光谱，即产物离子的m/z值；光谱仪以产品离子扫描模式运行。当第三个四极杆只允许选择产物离子时，分光计在所谓的多反应监测模式(MRM)下工作。当第一个四极杆允许在离子源中形成所有离子时，分光计为全质谱模式。在全质谱模式下工作时，三重四极杆系统的工作原理与经典四极杆分析仪相同。在全光谱测量中，前两个四极杆作为光束准直器，整个分析在第三个四极杆中进行。由于在选定物质的多反应监测模式下操作的可能性，三重四极杆串联质谱仪具有较高的灵敏度和选择性，因此它是目前与液相色谱仪结合用于食品中农药残留分析的最常用检测器。

2.2 四极杆-飞行时间串联质谱仪

四极杆-飞行时间(Q-TOF)串联质谱仪是目前与液相色谱联用的选择性最高的设备之一。它的特点是分离效率非常高。与QQQ类似，其工作原理基于四极杆串联，其中第三个四极杆由飞行时间分析仪取代。四极杆分析器中选择的前体离子在碰撞池中受到破碎，由此产生的产物离子以不同的速度通过飞行时间分析器并由检测器记录。Q-TOF串联质谱仪除了能够测定碰撞产生的产物离子的基本成分。此外，基于所分析离子的碎裂，还可以获得结构信息。Q-TOF串联质谱仪在用于食品中农药残留的分析，可以对农药的分子结构有一个掌握。

2.3 四极杆线性离子阱串联质谱仪

四极杆线性离子阱串联质谱仪(Q-trap)结合了四极杆的高灵敏度和离子阱的容量。除第三个四极杆被线性离子阱取代外，该器件为三重四极杆型。四极杆分析器中选择的离子在离子阱中碎裂。该系统的优点是离子阱可以独立测量碎片光谱，它与另一台分析仪的串联连接可以在MS/MS范围内记录碎片光谱。离子阱型装置的运行基于大量离子的积累，然后对这些离子进行碎片和分析。整个过程是周期性的。该循环在一个腔室中进行，包括选择要破碎的离子、与气体原子/分子碰撞以及分析破碎的离子。在食品中的农药残留分析中，四极杆线性离子阱串联质谱仪主要用于分析蔬菜和水果中的农药残留。

3 高效液相色谱质谱法在食品农药残留检测的研究进展

Sivaperumal等[9]基于固相萃取柱制备样品和超高效液相色谱/飞行时间质谱(UHPLC/TOF-MS)检测，采用多残留方法分析食品样品中的60种农药。UHPLC/TOF-MS定量是通过测量质子化分子[M+H]+的准确质量来实现的。如图1显示了一个秋葵样品中含有一个氯同位素模式的Myclobutanil精确质谱。氯同位素模式及其在分子或碎片离子中的丰度可作为鉴定的工具。通常获得的质量精度优于2×10-6。研究农药的回收率令人满意，在浓度低于10 μg/kg时，回收率在74%～111%，相对标准偏差(RSD)小于13.2%，大多数化合物的方法定量限(LOQ)低于食品安全标准规定的最大残留限量。使用每种农药的重复性、回收率和校准曲线数据确定不确定度。该方法适用于食品样品中农药的常规定量分析。

图1 (a)通过UHPLC-TOF/MS对秋葵样品进行的总离子色谱图(b)在样品中发现的霉氯丁腈提取离子色谱图

Tu等[10]将高效液相色谱/四极杆飞行时间质谱(HPLC/QTOF-MS)用于苹果中农药残留的定量测定。经过简单快速的提取，使用高分辨率多反应监测(HR-MRM)通过HPLC/QTOF-MS对农药进行定量检测。采用基质匹配外标法进行定量分析。通过在空白样品中加入分析物来验证所开发的方法，并通过回收率(78.9%～109.4%)以及良好的精密度(相对标准偏差)验证了令人满意的准确度(≤12.4%)。所有分析物的定量限在0.85～3.0 μg/kg。该方法已成功应用于40批实际样品的分析，证明了其常规应用的有效性。

Guo等[11]建立了一种测定谷物中多残留苯氧酸除草剂的高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)相结合技术，用于分析水稻、玉米和小麦中的苯氧酸除草剂。4-(2,4-二氯苯氧基)乙酸、(4-氯-2-甲基苯氧基)乙酸、(2,4,5-三氯苯氧基)乙酸和2-(2,4-二氯苯氧基)丙酸的检测限为0.0500 μg/kg，4-(2,4-二氯苯氧基)丁酸和3,6-二氯苯氧基苯甲酸的检测限为0.300 μg/kg。六种苯氧酸除草剂的日内和日间精密度的相对标准偏差小于6.61%，准确度为96.3%～107%。苯氧酸除草剂的提取回收率为73.8%～115%，在三个加标水平(1.00、4.00和20.0 μg/kg)下的相对标准偏差小于12.1%。结果表明，HPLC-MS/MS是一种快速、可靠、高灵敏度和特异性的谷物中苯氧酸除草剂残留测定工具。

Wang等[12]建立了一种快速、简便、廉价、有效、坚固、安全的样品制备方法，结合超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)测定草莓中43种农药残留。使用50 mg PSA+50 mg C18+150 mg MgSO4对净化吸附剂进行了优化，在d-SPE中表现出最佳性能。建议的方法线性范围为0.001～0.1 mg/kg，测定系数(R2)大于0.995。在三种浓度(0.01、0.05和0.1 mg/kg)下，所选农药的回收率为70.1%～119.6%，相对标准偏差(RSD)低于20%。43种农药的定量限(LOQ)≤0.005 mg/kg。本方法应用于北京郊区8个村采集的80个草莓样品，定量检测了12种农药残留，浓度范围为0.02～2.5 mg/kg。

4 高效液相色谱质谱法在食品农药残留检测的应用案例分析

4.1 实验部分

4.1.1材料与方法

样品从当地市场获得,使用5 mol/L的氨水将均质样品的pH值调整为6；然后将样品在超声波浴中处理15 min。超声处理后，使用研钵将1 g样品与1 g硅藻土均匀研磨5 min。然后将所得混合物转移到6 ml SPE管中。并用10 ml二氯甲烷以0.5 ml/min的速率洗脱农药残留。在温和的氮气流下将提取物蒸发至干燥。

4.1.2LC-MS分析

LC-MS系统由赛默飞世尔的设备组成，包括真空溶剂脱气装置、四元泵、带电喷雾接口的四极杆离子阱质谱仪和Xcalibur v.1.3软件包。分析物的分离在反相Zorbax Eclipse©XDB-C18色谱分离柱上进行，该柱规格为75 mm×4.6 mm，3.5 μm。在分离柱之前，安装了一个预柱，规格12.5 mm×4.6 mm，5 μm。采用梯度洗脱进行色谱分析，流动相由水(A)、甲醇(B)和10%乙酸(C)组成。梯度变化如下：0 min，A:33%，C:1%；7.5 min，B：58%，C：1%；25 min，B：99%，C：1%。重新建立初始条件并保持15 min，以确保注射之间的携带量最小。流动相流速为0.5 ml/min，将10 μl的最终提取物等分注射到HPLC系统中。

4.2 结果与讨论

研究表明，40%的食品样品至少对一种调查农药呈阳性。47%和48%的水果和蔬菜样品含有农药残留。根据这些监测项目，最常检测到的农药是多菌灵。此外，在我们的研究中，多菌灵是最常见的，因为它在87%的阳性样本中被发现。其他发现的农药包括乐果、啶虫脒和吡虫啉，分别在43%、25%和12.5%的阳性样本中检测到。在阳性样本中，43%检测到两种农药残留。一般来说，农药浓度超过最大残留限量(MRL)的样本数量并不多。只有不到3%的样本残留水平高于MRL。

5 结论

食品中农药残留的控制问题引起了越来越多的国家的高度重视，液相色谱-质谱法是用于分析食品中农药残留的有效检测手段。我们介绍了LC-MS系统的组成，讨论了流动相、吸附剂、MS分析仪的类型以及食品中农药残留分析中最常用的离子检测技术。在实际水果样品中验证了该方法在常规分析中的适用性。