5-羟色胺和氨海水对钝缀锦蛤解剖卵母细胞的体外促熟作用

巫旗生，祁剑飞，宁 岳，罗 娟，庞小鹏，郭 香，罗辉玉，曾志南*

(1.福建省水产研究所，福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建省海洋生物资源开发利用协同创新中心，海洋生物种业技术国家地方联合工程研究中心，福建 厦门 361013；2.集美大学水产学院，福建 厦门 361021)

钝缀锦蛤(Tapesconspersus)俗称“沙包螺”，隶属于软体动物门、瓣鳃纲、帘蛤目、帘蛤科，是中国南方沿海的重要经济贝类品种。钝缀锦蛤主要分布在中国、日本、菲律宾、印度、印度尼西亚、澳大利亚和新西兰等国家沿海地区，在中国常见于东海、南海及台湾海峡等[1]。钝缀锦蛤生长速度快、个体较大，具有较高的经济价值，目前在我国福建、广东、广西等沿海地区已经小规模养殖。国内外科研人员以钝缀锦蛤为研究对象，在种类鉴定[2-6]、繁殖生物学[7]、生态习性[8-10]、人工选育及养殖[11-15]等相关方面开展了大量的研究工作，但尚未见钝缀锦蛤卵母细胞体外促熟的相关文献报道。

1 材料与方法

1.1 精、卵的获得

实验用钝缀锦蛤为厦门市翔安区大嶝街道小嶝池塘养殖的2龄亲贝，平均体质量为(35.77±7.40)g，平均壳长为(62.44±3.91)mm，平均壳高为(40.53±2.34)mm，平均壳宽为(26.08±1.65)mm。钝缀锦蛤亲贝经过池塘暂养1个月后，从中挑选性腺成熟度好的个体，解剖获得精、卵。卵液用300目筛绢网过滤去除较大组织等，再用500目筛绢网收集卵子等。精液用500目筛绢网过滤杂质。检查卵子成熟度及精子活力等情况，并选择成熟度高的卵子及活力好的精子用于开展实验。

1.2 解剖卵母细胞的体外促熟

在室温(22℃)条件下，在50 mL离心管中分别加入30 mL成熟度高的卵液，然后加入不同浓度的5-HT和氨海水处理液，卵母细胞密度保持在500～1 000个/mL，混匀后开始计时。5-HT处理浓度梯度设定为0.01、0.1、1、10、100、1 000 μmol/L；氨海水处理浓度梯度设定为0.002 5%、0.005%、0.010%、0.015%、0.020%和0.025%。药品处理时间梯度分别为15、30、45、60 min。采用在自然海水中浸泡的卵母细胞作为对照组，每次实验设置3个平行组。

1.3 人工授精

用500目筛绢网过滤去除处理液，将卵子收集在500 mL烧杯中，然后加入2～3滴活力好的精子，充分混匀。在受精过程中，应尽量搅动受精卵液，保证溶解氧充足。

1.4 观察记录GVBD发生率和受精率

受精卵发育2 h后，取样进行显微镜拍照计数，同时计算GVBD发生率和受精率。

GVBD发生率=发生GVBD的卵子数/卵子总数×100%

(1)

受精率=卵裂的受精卵数量/卵子总数×100%

(2)

1.5 数据处理

实验数据使用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，采用Duncan’s多重比较检验不同组差异显著性，显著水平设置为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 钝缀锦蛤卵母细胞体外促熟的形态变化

解剖获得的钝缀锦蛤卵母细胞经过自然海水的浸泡，生发泡几乎不发生破裂(图1A)；采用一定浓度的5-HT、氨海水浸泡钝缀锦蛤卵母细胞后，生发泡发生了不同程度的破裂(图1B)。经过适宜浓度和处理时间体外促熟的卵母细胞受精后，部分受精卵可以正常发育(图1C)；当药物浓度过高或处理时间太长，会导致卵母细胞出现不受精、发育速度过慢、发育畸形等情况(图1D)。

注：A.生发泡未破裂的卵细胞；B.生发泡破裂的卵细胞；C.正常发育的受精卵；D.畸形受精卵。

2.2 5-HT对钝缀锦蛤卵母细胞的促熟作用

钝缀锦蛤解剖卵母细胞在正常海水中浸泡一段时间后，生发泡几乎不会发生破裂；采用5-HT浸泡可以显著促使钝缀锦蛤卵母细胞的成熟(图2)。当处理时间相同时，采用10 μmol/L～1 mmol/L 5-HT 浸泡钝缀锦蛤卵母细胞，GVBD发生率差异不显著(P>0.05)；采用0.01～1 μmol/L 5-HT 浸泡钝缀锦蛤卵母细胞，GVBD发生率差异显著(P<0.05)，表现出一定的浓度依赖关系。除45 min和60 min同一浓度实验组之间差异不显著(P>0.05)外，其他不同时间同一浓度实验组差异显著(P<0.05)，表现出一定的时间依赖关系。

钝缀锦蛤的卵母细胞经过不同浓度5-HT浸泡处理后，人工授精的受精率见图3。卵母细胞经过5-HT浸泡后，可以显著提高受精率(P<0.05)。除了0.01～0.1 μmol/L 5-HT实验组外，其他实验组(1 μmol/L～1 mmol/L 5-HT)表现出一定的时间依赖关系，受精率随时间增加而提高。当处理时间相同时，表现出一定的浓度依赖关系，1～10 μmol/L 5-HT实验组的受精率显著高于其他实验组(P<0.05)；其中，10 μmol/L 5-HT浸泡60 min实验组受精率最高，达到48.57%。

2.3 氨海水对钝缀锦蛤卵母细胞的促熟作用

对钝缀锦蛤解剖卵母细胞采用一定浓度的氨海水浸泡，可以显著促使卵母细胞的成熟(图4)。当处理时间相同时，采用0.002 5%～0.010%氨海水浸泡钝缀锦蛤卵母细胞，GVBD发生率差异不显著(P>0.05)；采用0.015%～0.025%氨海水浸泡钝缀锦蛤卵母细胞，GVBD发生率差异显著(P<0.05)，表现出一定的浓度依赖关系。除了0.002 5%氨海水实验组外，其他实验组随着处理时间的增加，GVBD发生率差异显著(P<0.05)，表现出一定的时间依赖关系。

钝缀锦蛤的卵母细胞经过不同浓度氨海水浸泡处理后，人工授精的受精率见图5。卵母细胞经过氨海水浸泡后，可以显著提高受精率(P<0.05)。除了0.002 5%～0.005%、0.025%氨海水实验组外，其他实验组(0.015%～0.020%氨海水)表现出一定的时间依赖关系，15 min至45 min时间内受精率随时间增加而提高。当处理时间相同时，表现出一定的浓度依赖关系，0.015%～0.025%氨海水实验组的受精率显著高于其他实验组(P<0.05)；其中，0.020%氨海水浸泡45 min实验组受精率最高，达到50.75%。

采用不同浓度的氨海水浸泡钝缀锦蛤卵母细胞，虽然可以获得较高GVBD发生率和受精率，但受精卵的畸形率较高，部分受精卵在卵裂过程中就停止胚胎发育。

3 讨论

3.1 5-HT和氨海水对海水贝类卵母细胞促熟作用

在海水贝类人工育苗过程中，亲贝性腺成熟程度非常关键，卵子质量的好坏直接决定整个育苗过程的成功率[28]。海水贝类卵母细胞的形态、GVBD发生率以及细胞器的状态等都是判断卵母细胞成熟度的重要依据[29]，因此，在开展钝缀锦蛤解剖卵母细胞的体外促熟过程中，应选择卵径在70～80 μm、形状圆形的卵母细胞。海水贝类的解剖配子存在两种状态：一种是卵生型牡蛎等[30]的解剖卵母细胞可以直接人工授精发育，而绝大部分海水贝类，如菲律宾蛤仔、硬壳蛤(Mercenariamercenaria)、马氏珠母贝(Pinctadafucata)、栉孔扇贝(Chlamysfarrer)等解剖卵母细胞不能直接受精或受精率极低[31]，这是因为解剖卵母细胞含有的生发泡在生理上是不成熟的，必须经过一定浓度的药物(5-HT、氨海水、维生素、多巴胺等)浸泡处理后，卵母细胞才能够受精。

本研究采用了5-HT和氨海水浸泡钝缀锦蛤解剖卵母细胞，结果表明5-HT和氨海水均能够促使卵母细胞的生发泡破裂，GVBD发生率达到80%以上，受精率达到45%左右。采用5-HT和氨海水浸泡卵母细胞，钝缀锦蛤与其他海水贝类获得的最高GVBD发生率和受精率各不相同(表1)，这可能与不同种类生活习性及生活环境条件(温度、pH等)有关。

表1 海水贝类卵母细胞经5-HT和氨海水浸泡获得的最高GVBD发生率和受精率

3.2 处理时间和药物浓度对钝缀锦蛤卵母细胞受精发育的影响

卵母细胞的生发泡破裂是卵子成熟最明显的标志[16]，因此采用不同浓度药物和不同处理时间，可以有效地提高解剖卵母细胞的GVBD发生率和受精率。5-HT和氨海水作为海水贝类卵母细胞体外促熟有效的化学药物，在海水贝类繁殖过程中起着非常重要的作用，特别是在促使卵母细胞进一步成熟等方面[22]。

邸炜鹏等[19]采用0.005%氨海水处理15 min后、再用2 mmol/L 5-HT处理栉孔扇贝解剖卵子，卵子的受精率达到40.02%。李浩浩等[27]采用一定浓度的氨海水(0.008%～0.014%)浸泡栉江珧解剖卵母细胞40～60 min，可以显著提高GVBD发生率和受精率，受精卵在发育过程中的畸形率较低；而采用5-HT、多巴胺和维生素浸泡卵母细胞，体外促熟效果不明显。本研究表明，1～10 μmol/L 5-HT和0.015%～0.025%氨海水均能够显著提高钝缀锦蛤解剖卵母细胞的GVBD发生率和受精率，0.015%～0.025%氨海水实验组的GVBD发生率高于1～10 μmol/L 5-HT实验组，虽然受精率相似，但氨海水实验组的受精卵发育过程中畸形较多；当药物浸泡时间为45～60 min时，GVBD发生率和受精率达到了最大值。因此，对钝缀锦蛤解剖卵母细胞进行体外促熟时，药物浓度及浸泡时间应控制在适宜范围内，从而确保较高的GVBD发生率和受精率。

3.3 解剖授精在海水贝类遗传育种中的作用

目前在海水贝类人工育苗生产中，只有牡蛎等极少数海水贝类采取人工授精方法进行育苗生产，其他海水贝类主要采用人工催产方法进行育苗生产[31]。由于海水贝类是分批成熟、分批产卵的，在人工催产时的产卵不同步、产卵时间长等因素都直接影响育种工作的顺利开展。因此，开展海水贝类卵母细胞的体外促熟方法研究可以解决卵子受精同步性等问题，为海水贝类多倍体育种、选择育种、杂交育种的开展提供有力的技术支撑。