超临界CO2 萃取化橘红精油工艺研究

郭星洁，刘惠青，马兆成*

（1.华中农业大学园艺林学学院，康养园艺研究院，湖北武汉 430070；2.化州市化橘红研究所，广东化州 525100）

化橘红为芸香科植物化州柚（Citrus grandis‘Tomentosa’）或柚（Citrus grandis(L.)Osbeck）未成熟或近成熟的干燥外层果皮，因其药效独特而被誉为“十大广药”之一，分布于我国广东、广西等地。《本草纲目拾遗》记载，“橘红治痰涎、消油腻、消食、醒酒、宽中、解蟹毒”，具有理气化痰、润肺止咳的显著药用功效[1-2]。化橘红还具有独特的香气，可作为一种香气浓郁的天然香料。化橘红精油中含量较高的挥发性萜类物质柠檬烯、月桂烯等成分，具有抗菌、助消化的药理活性[3]，在医药、食品加工和日用化工等行业领域中具有非常重要的应用价值。

目前，化橘红精油的提取通常采用水蒸气蒸馏法[4]、无水乙醇超声辅助提取法[5]和饱和水溶液提取法[6]，均需对样品进行复杂的脱水处理，且提取物中杂质较多，耗时长，提取效率低。研究表明，超临界CO2萃取是一种快速、简单且环境友好的方法，可以有效解决蒸馏法的香气成分受热变质问题以及有机溶剂提取法的溶剂残留问题，在精油提取方面具有广阔的应用前景[7-8]。超临界CO2萃取（supercritical carbon dioxide，SC-CO2）工艺是利用超临界状态的CO2作为溶剂直接将天然香料溶解抽取的提取方法[9]。CO2作为萃取剂具有无毒、无菌、无污染的特点，在高压、密闭环境下选择性萃取，使精油得率和资源利用率大大提高[10]。因此，本文通过响应面试验优化超临界CO2萃取化橘红精油的工艺条件，选择萃取温度、萃取压力、萃取时间3 个因素，将精油得率作为评价指标，进行Box-Behnken 中心组合设计[11]，得到三元二次方程来拟合响应面分析，发现并优选精油提取工艺条件，为进一步地发展和有效利用化橘红提供新途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

化橘红鲜果，采自广东省化州市平定积田大岭村。

无水乙醇，分析纯，上海沪试有限公司；CO2气体，纯度＞99.9%，武汉深冷有限公司；正己烷，色谱纯，上海沪试有限公司；脱脂棉，南昌朝阳医疗保健有限公司；实验用水由Milli-Q 超纯水仪制备。

1.2 仪器与设备

超临界CO2提取装置，ASI SFE-2，美国Applied Separations（ASI）公司；电子天平，JY1002，上海精平有限公司；高速多功能粉碎机，800Y-7，永康市铂欧五金制品有限公司；冷冻干燥机，SCIENTZ-10N，宁波新芝生物科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 化橘红鲜果精油萃取工艺流程

化橘红果皮→冷冻干燥→粉碎过筛→超临界CO2萃取→化橘红精油

1.3.2 操作要点

将化橘红鲜果果皮削下，冷冻干燥48 h，粉碎过30目筛，称取质量记为m1，放入萃取釜，并将萃取釜两端塞入脱脂棉准备萃取。检查所有阀门为关闭状态后，开启恒温槽降温，当温度低于室温10 ℃左右时，开启CO2钢瓶阀门和空压机，待稳定后开启萃取釜阀门，设置一定的温度及压力，待其恒定后调整流速并进行计时，保证萃取时间大于0.5 h，停机，开萃取器的出口阀，获得化橘红精油（m2）。

1.3.3 精油提取的单因素试验

在固定萃取流量5 L/h、萃取压力25 MPa、萃取时间60 min、萃取温度45 ℃的基础上，以化橘红精油得率为指标，设置单因素试验，分别考察萃取时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）、萃取压力（10、15、20、25、30 MPa）和萃取温度（30、35、40、45、50 ℃）对化橘红精油得率的影响[12]。

1.3.4 超临界CO2萃取工艺响应面优化

基于单因素试验，按照Box-Behnken 试验的要求使用Design-Expert 11，设计响应面试验方案[13]。分别用A、B、C 来表示萃取压力、萃取温度及静态萃取时间，并以-1、0、l 分别表示对应变量，以化橘红精油提取率为响应值进行响应面分析，因素与水平见表1。

（1）教师对教学内容划分出一级知识点和相对独立的二级知识点，对每个二级知识点录制10 分钟左右的教学视频。

表1 响应面试验设计因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.4 指标测定

精油得率是影响生产成本的重要衡量标准，因此调整化橘红超临界CO2萃取工艺可以有效提高精油得率，为化橘红精油质量与鲜皮质量之比[14]，见式（1）。

1.5 数据处理

采用Excel 2013 对试验数据进行整理，依据Box-Behnken 中心组合试验设计原则，使用Design-Expert 8.0.6 对响应面进行了统计分析，并利用SPSS 18.0 对其进行方差分析和显著性检验。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 萃取温度对精油得率的影响

由图1 可知，随着萃取温度的升高，化橘红精油得率先增加后减少，当温度达到35 ℃时，精油得率达到峰值，可达4.5%，40 ℃时萃取得率较35 ℃时的萃取得率有所下降，但仍然大于30 ℃时的萃取得率。这是因为随着温度的升高，香气成分不断溢出，得率随之升高，在40 ℃时萃取得率有所下降，可能是萃取釜中CO2物理形态的变化所造成的[15]。因此，萃取温度选择35 ℃。

2.1.2 萃取压力对精油得率的影响

2.1.3 萃取时间对精油得率的影响

由图3 可知，随着萃取时间的延长，化橘红精油得率呈现先上升后略微下降的趋势；当萃取时间达到1.5 h时，精油得率最大，达4.3%；萃取2 h 时，精油得率变化不大，说明萃取时间的延长已经无法增加精油得率，而且萃取时间太长会将化橘红中的黄酮类物质如柚皮苷提取出来，影响化橘红精油的萃取[17]。因此萃取时间选择1.5、2.0、2.5 h 进行响应面优化实验。

2.2 响应面优化设计试验

2.2.1 响应面试验萃取参数设定

在单因素试验分析的基础上，选取对化橘红精油萃取得率影响较大的因素进行响应面试验，得到Box-Behnken 试验因素水平编码表。响应面试验结果见表2（见下页）。

表2 响应面试验结果Table 2 Results of response surface experiments

2.2.2 建立数学模型及方差分析

根据表2 的试验结果，采用Design-Expert 11 软件对所得试验数据进行回归分析及回归方差分析显著性检验，结果见表3。由表3 可知，通过对试验数据进行多元回归分析，可以通过以下二阶多项式方程的多元回归得到预测的精油产率，所得回归方程为Y=-63.704+2.355A+1.279B+8.983C+0.004AB-0.067AC+0.019BC-0.032A2-0.027B2-1.829C2。其中，A、B、C 分别为测试变量的编码因子。由表3 可知，模型P＜0.000 1，小于0.05，差异极显著，表明模型具统计学意义[18]；模型F=99.18，表明该模型具有显著性，且由于噪声只有0.01%的可能性会出现如此大的F值。失拟项P=0.053，表明不显著，说明该模型失拟因素不存在；R2=0.992 2，表明该因素中有99.22%影响了响应值变化；预测的R2为0.895，与调整后的R2为0.982 2 相对差异不大，且均大于0.80，表明该模型拟合程度符合标准，因此回归方程可用于对超临界CO2萃取化橘红精油条件进行预测[19]。

根据表3 中F值可知，化橘红精油收率的影响因子从大到小为B 萃取压力、A 萃取温度、C 萃取时间。由P值可知，A、B、BC、A2、B2、C2极显著影响化橘红精油得率（P＜0.01），AC、AB、C 显著影响化橘红精油得率（P＜0.05）。

表3 二元多项式模型的预估回归系数和方差数据分析（ANOVA）Table 3 Predicted regression coefficients for binary polynomial models and variance data analysis (ANOVA)

2.2.3 多因素间交互作用分析

根据回归方程利用Design-Expert 11 软件做不同因素的响应面分析，结果如图4 所示，图（a）～（f）表示萃取压力、萃取温度、萃取时间其中两个变量交互作用对超临界CO2萃取化橘红精油提取效果的研究。响应曲面越曲折，交互作用越强。因此，图4（a）为近圆形等高线，说明萃取压力和萃取时间交互作用较弱；图4（c）（e）等高线较陡，说明萃取时间和萃取温度之间、萃取时间和萃取压力之间交互作用明显；图4（b）为响应面弧度明显，而图4（d）（f）响应面较为平缓，说明萃取温度和萃取压力对化橘红精油得率影响较大，而萃取时间对精油得率影响较小。综上，交互作用显著的是A 萃取温度与B 萃取压力，此结果与表3结果相同。

3 结论

本研究通过超临界CO2萃取的方法提取化橘红精油，分析萃取温度、萃取压力和萃取时间对化橘红萃取率的影响，建立回归方程模拟实验并根据Box-Behnken响应面试验设计结果进行验证，在各因素的方差分析中表明：萃取压力与萃取温度对化橘红精油得率影响达极显著水平；在多因素交互分析中，萃取温度与萃取时间的交互作用显著，其他两个变量两两交互作用都不显著；使用Design-Expert 11 研究不同条件下化橘红精油提取效果的最佳工艺为萃取温度36.22 ℃，萃取压力26.75 MPa，萃取时间1.92 h，化橘红精油收率预测值为4.68‰。根据操作试验的可行性，将实施条件修改为萃取温度36 ℃，萃取压力27 MPa，萃取时间1.9 h，并进行3次重复试验，得到化橘红精油的平均收率为4.53‰，与响应面预测结果一致[20]。

目前，超临界CO2萃取得到的有效成分通常具有较高的药理活性,但部分研究对象药理活性与其较高的得率不成正比，因此需进一步纯化解析化橘红药材香气成分。在此基础上，还需结合功效做相应的提取工艺研究和设备设计优化应用于生产，为今后综合利用开发化橘红超临界萃取物提供科学依据。