牛、山羊和骆驼酸奶营养与理化特性的比较研究

张亦, 王亮, 吕自力, 邓凯文, 吴涛, 顾雅纯, 田会敏, 刘威

（1.江苏大学食品与生物工程学院, 江苏镇江 212013；2.成都中医药大学医学与生命科学学院/附属生殖妇幼医院, 成都 610000）

0 引言

乳中富含丰富的蛋白质、脂质、维生素、矿物质以及各种生物活性物质, 被誉为“白色血液”和“接近完善的食品”, 是人类获取营养的主要途径之一[1]。牛乳占乳制品市场的95 %, 是人类利用最多的动物乳, 其为人类提供必需营养物质[2]。近年来, 随着人们对乳制品的需求量的增加, 牛乳在生产规模及营养价值等方面已逐渐不能满足市场需求。山羊乳口感细腻, 味微甜, 香中带咸, 被誉为乳中佳品[3]。山羊乳的各项营养元素配比与人乳更为相似, 其消化吸收速度也明显高于牛乳和母乳[4-5]。并且山羊乳的平均脂肪粒径小于牛乳的脂肪平均粒径, 因此山羊乳中的脂肪更容易消化。骆驼乳作为蛋白质、必需脂肪酸、维生素B1、钾、磷和钙的良好来源之一, 乳中有一种富含半胱氨酸的蛋白, 其一级结构与胰岛素蛋白质家族极为相似, 能快速通过胃进入肠道循环。因此, 骆驼乳在抵御糖尿病方面, 可减少对胰岛素的依赖, 提高葡萄糖耐力[6]。

奶粉可以保留生乳中大部分的营养物质, 大幅度降低体积与重量, 延长货架期, 并减少运输及储存的成本。当前, 同时开展以牛奶粉、山羊奶粉及骆驼奶粉为原料的发酵酸奶的研究较少。牛乳为乳制品行业中研究应用最多, 且为大众普遍接受。山羊乳因具有独特的羊膻味使其发展受到限制, 但风味与乳中成分密切相关。骆驼乳主要源于沙漠地区, 供应量不足及降血糖等特殊生理功能, 使其价格显著高于其他两种乳品。本研究将从营养学与物理化学的角度, 明确3种酸奶的营养价值, 筛选出3种酸奶间具有显著性的挥发性差异代谢物, 通过全质构以及流变学特性分析, 对3种酸奶的品质稳定性进行鉴定。3种酸奶制品之间的比较研究, 可以帮助我们更加深入的认识不同原料乳来源的发酵酸奶之间的区别, 增加对特种乳的认知, 了解不同特种乳品的品质特征。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

DANISCO 300型商业发酵剂, 由中国丹尼斯克有限公司提供。

1.1.2 试剂

牛奶粉购自光明乳业股份有限公司；山羊奶粉购自新西兰卡瑞特兹有限公司；骆驼奶粉购自新疆源西域生物科技有限公司；De Man Rogosa Sharpe(MRS)培养基购自青岛海博生物技术有限公司；1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)自由基、95%乙醇、盐酸, 苯酚, 柠檬酸钠缓冲溶液, 茚三酮溶液, 混合氨基酸标准溶液等购自上海生工生物有限责任公司。

1.1.3 仪器与设备

FE20K酸度计, 中国；S-433D氨基酸自动分析仪, 德国；TQ8040气相质谱联用仪, 日本；TA-XT2i质构测试仪, 英国；DHR-1旋转流变仪, 美国。

1.2 方法

1.2.1 样品制备

牛、山羊、骆驼奶粉分别做5组酸奶, 每组酸奶样品包括3个平行。按照15%的比例, 分别用50～60℃的水溶解3种奶粉, 搅拌均匀, 即获得牛、山羊、骆驼复原乳。95℃震荡水浴5 min, 待复原乳温度降至室温后, 按比例0.0024%（质量分数）接种DNASCO 300型商业发酵剂, 于42℃静置发酵至凝乳后, 置于4℃冷藏1 d后进行各项指标测定。

1.2.2 活菌数、酸度、pH及持水力测定

活菌数的测定采用平板计数法[7]。酸度采用酸碱滴定法[8]。采用pH酸度计测定3种酸奶的pH。持水力的测定参照文献[8],并做部分修改。取10 g样品于4℃转速为10 000 r/min, 离心30 min。持水力如下：

注：W1为酸乳样品质量(g)；W2为上清液质量(g)。

1.2.3 抗氧化活性测定

参照文献[9]的方法, 用DPPH自由基清除率来评价不同酸奶样品的抗氧化活性。上清液收集的离心条件参照持水力实验。以95%乙醇为溶剂制备0.0003%DPPH溶液（质量分数）。以95%乙醇为空白, 2 mL DPPH溶液中加入1 mL 95%乙醇为对照。取不同酸奶样品的上清液500μL, 加入500μL 95%乙醇和2 mL的DPPH溶液, 混匀后室温暗处反应30 min, 于517 nm测定吸光度。抗氧化活性计算如下：

注：A0为空白的吸光度；A1为不同样品的吸光度。

1.2.4 主要成分与氨基酸组成

参照文献[10]分别测定3种酸奶中粗蛋白、脂肪、总固体、脱脂固体及灰分的含量。氨基酸组成测定方法参照文献[11]。

1.2.5 挥发性香气成分测定

采用全自动气相色谱-质谱联用, 对酸牛奶、山羊酸奶、骆驼酸奶中的挥发性化合物进行测定。每组酸奶取5个平行样本, 每样本称取8 g于15 mL顶空瓶中, 于50℃、300 rpm下平衡2 min, 萃取20 min, 于250℃解吸附3 min。实验采取程序升温方式, 初始温度40℃、持续3 min, 以5℃/min的速率升温至140℃, 保持2 min, 再以10℃/min的速率升温至240℃, 保持5 min。载气为氦气, 进样口温度为250℃。MS条件：电离电压70 eV,离子源温度250℃, 扫描范围33～500 u, 发射电流100μA, 检测电压1.4 kV。定性检测基于GC-MS工作站的标准数据库检索各个组分的质谱数据, 定量检测根据峰面积归一法计算各物质峰面积的相对含量百分比。

1.2.6 全质构分析

采用TA-XT2i物性仪分别测定3组酸奶的全质构特性。每组样品设置3个平行。用勺子移取等量的样品于容器中, 4℃放置2 h后进行测定。测定条件如下：采用SMS P/25柱状探头, 测前速率1 mm/s、测定速率1 mm/s、测定距离5 mm, 测定后速率1 mm/s、触发力5 g、时间5s。测定结束后得到样品的硬度、黏附性、凝聚性和胶黏性。

1.2.7 流变学特性分析

3组酸奶样品流变学特性的测定方法参照杨希娟论文[12]。

1.3 数据分析

采用EXCEL 2020进行数据处理, 每个样品测定3次, 结果表示为平均值±标准差；用Origin 2018软件绘图并对不同样品的GC-MS数据做主成分分析；采用SIMCA 14.1软件进行正交偏最小二乘判别分析；采用SPSS 23.0软件中Kruskal-Wallis检验对VIP＞1对应的物质进行P值验证,利用R Studio软件绘制热图并分析每组样品的差异性代谢物。

2 结果与讨论

2.1 总活菌数、滴定酸度、pH及持水力

总活菌数反映微生物的生长状况。营养物质的种类和含量越丰富, 活菌数越高。牛、山羊、骆驼酸奶中总活菌数分别为0.92×109CFU/mL、1.74×109CFU/mL和3.65×109CFU/mL。骆驼酸奶中活菌数显著高于其余两者（P＜0.05）,说明骆驼酸奶更适于乳酸菌的生长。酸度与pH主要受乳酸菌发酵乳糖产生乳酸所影响。3种酸奶的滴定酸度分别为91.23±0.15、89.32±0.71、86.21±0.13, pH分别为4.18±0.23、4.26±0.15、4.70±0.56, 且三者间的酸度与pH均具有统计学差异（P＜0.05）。因此, 乳糖含量和活菌数越高, 产生乳酸含量也越高, pH值越低。

持水力是评价蛋白结合水分子的能力, 蛋白胶束间的交联状况影响持水力的大小。三者持水力由高到低为：山羊酸乳（72.24±0.63）、酸牛乳（60.12±0.23）及骆驼酸奶（44.59±0.52）。骆驼酸奶的低持水力与脆弱质地密切相关, 其内部蛋白胶束间孔隙大, 造成结合水分少[13]。因此, 为改善酸乳质地, 减小蛋白胶束间空隙, 可使用高产胞外多糖的菌种, 使发酵过程中产生的胞外多糖可与蛋白胶束相互作用, 进而提高持水力。

2.2 抗氧化活性

DPPH自由基具有单一电子且结构稳定, 溶液呈紫色, 于517 nm处有稳定吸收。因此, 采用光谱法定量分析清除剂的抗氧化活性[14]。抗氧化活性越强, 吸光度越低。经检测, 酸牛奶、山羊酸奶及骆驼酸奶的抗氧化活性依次为56.63%±1.34、59.47%±1.25和62.31%±2.25。骆驼酸奶的抗氧化活性显著高于山羊酸奶和酸牛奶（P＜0.05）, 说明不同样品抗氧化活性与其组分及性质密切相关[15]。

2.3 主要成分与氨基酸组成

经检测, 酸牛奶的粗蛋白含量(3.34±0.12)和脂肪含量(3.83±0.06)显著低于其余两种酸奶（P＜0.05）。其中, 骆驼酸奶中粗蛋白含量最高(3.69±0.56), 山羊酸乳的脂肪含量最高(4.9±0.43), 且三者间具有统计学差异(P＜0.05)。总固体(14.25±0.54)、脱脂固体(12.22±0.26)及灰分的含量(0.98±0.15)在酸牛乳中最高, 而在骆驼酸奶(13.72±0.35,10.29±0.39,0.72±0.09)和山羊酸奶(12.23±0.13,9.92±0.64,0.65±0.13)中, 分别显著降低（P＜0.05）。

3种发酵酸奶的氨基酸组成结果如表1所示, 共检测到17种氨基酸。在3种酸奶中, 氨基酸含量最高的前3位皆为谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸。必需氨基酸和非必需氨基酸中含量最高的分别为亮氨酸和谷氨酸。亮氨酸是构建肌肉的3种必需氨基酸之一, 具有调节血糖、支持能量供应等功能[16]。谷氨酸为细胞内重要递质与组分, 也是谷胱甘肽的前体物质, 可帮助机体清除有毒化合物[17]。通过比较发现, 骆驼酸奶中半胱氨酸明显高于其余两种酸奶, 菌种的发酵作用促进了蛋白分解。这与文献[6]等认为骆驼奶中的蛋白质富含半胱氨酸的研究结果一致。山羊酸奶的总氨基酸TAA、必需氨基酸EAA和非必须氨基酸NEAA是3种酸奶中最高的, 酸牛奶、骆驼酸奶依次次之, 表明山羊酸奶的营养价值更丰富。而且, 3种酸奶的EAA/TAA均高于40%, EAA/NEAA均高于70%, 达到FAO/WHO要求的EAA/TAA和EAA/NEAA的理想蛋白质标准。因此, 3种酸奶的蛋白质均为完全蛋白质和优质蛋白质, 属于理想蛋白质范畴, 具有较高的营养价值。

表1 3种酸奶的氨基酸组成比较 mg/g

2.4 GC-MS分析

酸牛奶、山羊酸奶及骆驼酸奶中挥发性风味代谢物的分析结果见表2。

表2 牛、羊、驼酸奶的挥发性化合物组成

（续表2）

（续表2）

经过GC-MS分析, 3种乳源酸奶的挥发性化合物主要有酸类、烷烃类、脂类、酮类、醛类、醇类及其它类构成。对每组样品中各个色谱峰进行质谱分析, 酸牛乳、山羊酸奶、骆驼酸奶分别检测出55种、67种、63种挥发性代谢物。其中酸牛乳中主要的风味物质为酮类物质30.67%、醇类物质21.6%及脂类物质20.68%, 物质与含量分布合理、分散, 风味柔和, 具有典型的发酵乳风味。骆驼酸奶中挥发性物质大部分为酸类物质31.04%, 脂类物质17.95%, 酮类物质17.22%, 醇类物质20.86%, 其中乙酸含量为11.63%, 代谢物比例较为不均衡。山羊酸奶中酸类物质高达65.92%, 酮类物质11.43%, 醇类物质10.83%。酸类物质含量尤为丰富。其中, 辛酸、月桂酸和癸酸含量分别为8.56%, 11.79%和22.17%, 说明酸类物质可能与山羊酸奶中突出的羊膻味有关。上述结果与报道结果相近[18-19], 即认为辛酸、壬酸和癸酸是羊乳中主要致膻成分, 降低辛酸和癸酸的含量可以在一定程度上减少乳品的羊膻味。

酸类物质作为酸奶中主要的风味物质, 主要体现在滋味。酸类物质的含量由高到低排序依次为山羊酸奶、骆驼酸奶、酸牛奶。烷烃类物质在酸牛奶、山羊酸奶及骆驼酸奶中的种类数分别为5种、3种和6种, 但酸牛奶中的含量最高。脂类物质阈值低, 风味明显, 主要来自于脂肪酸水解和细菌作用产生[20]。脂类物质在酸牛奶、山羊酸奶和骆驼酸奶中分别为8种、8种和11种。醇类物质在山羊酸奶中种类数多于酸牛乳和骆驼酸乳, 但山羊酸奶中醇类物质的含量明显低于其余两者。由于醇类物质的风味阈值高, 对酸奶的风味贡献度不明显, 主要起辅助作用。酮类物质作为多种物质的中间体, 主要由脂肪酸和肽类物质降解及细菌代谢产生[20]。3种酸奶中共检测到9种酮类物质, 含量丰富, 对酸奶风味作用明显。醛类物质在山羊酸奶中构成及含量明显高于其余两种酸奶, 阈值较低, 是各种氧化风味的重要来源。其它类别化合物主要由含硫物质和含氮物质组成, 风味阈值低, 对整体风味形成较为重要。

2.5 OPLS-DA建模与模型评价

根据GC-MS数据, 首先, 对三种酸奶进行无监督的主成分分析。如图1所示, 不同样本沿着第一主成分强烈分布（PC1、PC2分别为52.0%和35.0%）, 聚类显著, 即组间代谢物的成分与含量都存在明显差异。随后, 进行有监督的OPLS-DA建模分析。理论上R2与Q2越接近1.0, 拟合度越高。如图2所示, 所建立的模型中见图2（a）, R2X为0.87, R2Y为0.996, Q2为0.994, 说明所建立模型的解释度和拟合度良好。然后, 为避免OPLS-DA模型无法对新样本进行有效预测而表现出过度拟合, 进一步采取SIMCA 14.1中置换检验和交叉验证分析对模型可靠性进行验证。置换结果如图2（b）中所示, 经200次置换交叉验证后, Q2点的回归线与纵坐标的截距小于0, 说明模型没有过拟合。同时交叉验证分析结果证明, 3种酸奶的显著概率值P=1.16×10-20＜0.05,说明该研究下所建立的模型稳定可靠, 具有统计学意义。最后, 筛选3种酸奶的潜在差异性代谢物。VIP是OPLS-DA模型的变量权重值, 可用来衡量各组分累计差异对组间样本分类判别的影响强度和解释能力。通常认为VIP值越大, 该化合物对样品间聚类的贡献率越大。根据VIP＞1的标准[21], 共筛选出52种代谢物, 并采用Kruskal-Wallis检验对筛选出VIP＞1的化合物进行单变量分析[22]。分析结果如表3所示, 筛选出的52种物质在3种酸奶中含量均具有显著性。

表3 基于OPLS-DA模型分析VIP＞1代谢物的P值

图1 主成分分析

图2 3种酸奶的多元统计分析

（续表3）

2.6 层次聚类分析

为进一步分析酸牛乳、山羊酸奶、骆驼酸奶的挥发性香气化合物构成及含量的差异, 将所筛选的52种具有显著性的物质先经过标准化处理, 后进行谱系与heatmap分析, 以更直观的体现52种化合物在3种酸奶中的联系。

由图3可知, 通过层次聚类分析, 可将3种乳品的特征代谢物分为五大类。颜色越红代表浓度也高。A、C、D中物质分别为山羊、牛、驼乳区别于其他两种乳品的主要风味物质。B类物质中含有正戊醇、己酸、正己醇、乙酸、壬酸, 为山羊酸乳和骆驼酸乳所共有, 而在酸牛乳中含量极低, 说明其在山羊酸奶和骆驼酸奶中膻味表现有一定作用。正戊醇有水果和脂肪气味；己酸具有辛辣、花香和较淡腐臭味；正己醇表现为土壤和汽油味；乙酸的气味表现为醋, 辛辣和醋酸的气味；壬酸呈淡的脂肪和椰子香气[23]。丙位十二内酯、棕榈酸异丙酯、1-十四醇、十九醇的含量在山羊酸奶、酸牛奶和骆驼酸奶中依次升高, 表示这4种物质是兼具酸牛乳和骆驼酸奶风味的关键物质。

图3 52种代谢物的热图和HCA聚类结果在3种乳品中有显著差异(VIP值＞1)

2.7 全质构分析

全质构分析是评价酸奶质量的一个重要指标, 以酪蛋白间形成的蛋白胶束为基础, 与酸奶的内部结构密切相关。由表4可知, 酸牛乳、山羊酸奶及骆驼酸奶的硬度依次降低, 硬度主要受到胞外多糖与酪蛋白的影响。黏附性是样品二次压缩间的负面积, 反映探头克服样品黏着所做的功, 样品的黏性越大, 则黏附性的绝对值越大。3种样品的黏附性绝对值表现为FM＞FG＞FC。内聚性指样品第一次压缩后呈现出对第二次压缩的相对抵抗力, 结果从大到小依次为FC＞FM＞FG。胶黏性模拟半固体样品破裂成吞咽时的稳定状态所需的能量, 结果与硬度一致。综合硬度、黏附性、内聚性和胶黏性4个指标认为, 酸牛奶的内部结构最为稳定, 山羊酸奶次之, 骆驼酸奶最差。

表4 酸牛乳、山羊酸奶、骆驼酸乳的全质构分析

2.8 流变学特性分析

流变学特性研究时间和力等外界条件对酸奶变形情况的影响[24], 常从表观黏度、触变特性与应变扫描进行测定与评价。根据研究[25],β-乳清蛋白与酪蛋白的交联作用是酸奶流变特性的基础, 并对后续发酵过程中胶束的建立和水合过程产生重要影响。

如图4所示, 为牛、山羊、骆驼酸奶的流变学特性分析图。3种酸奶的表观黏度随着剪切速率的增加, 先剧烈降低后趋于平缓见图4（a）, 即呈现出剪切稀释的流动特征, 因为剪切力破坏了酸奶的内部结构进而使黏度下降。3种酸奶的表观黏度的变化趋势虽然相同, 但初始表观黏度值在酸牛乳、山羊酸奶、骆驼酸奶中依次降低。酸奶样品的升速与降速剪切曲线可大致形成触变环见图4（b）, 即在剪切力作用下样品的组织结构会发生改变, 撤去作用力后恢复状态需要滞后一段时间。3种酸奶的触变环形态明显不同, 表明其触变特性迥异。3种酸奶的触变环面积的大小表现为FG＞FM＞FC。触变环面积越大说明在剪切力作用下, 内部组织结构发生的变化越大, 且恢复速度较慢。应变扫描是模拟酸奶从生产到销售全过程中受到的作用力, 结果以储能模量G＇与损耗模量G＂表示见图4（c）。3组酸奶样品中G＇＞G＂, 说明储能模量优于损耗模量, 结构上呈现一定程度的固体特性。其中, 山羊酸奶的储能模量最高, 酸牛乳次之, 骆驼酸奶最低。

图4 3种酸奶的流变特性分析图

分析牛、山羊、骆驼酸奶的流变学特性时发现, 牛、山羊酸奶在外力剪切作用下, 内部结构均发生较大改变, 而骆驼酸奶的组织状态变化幅度较小, 这与3种酸奶所呈现的状态直接相关。凝乳后牛、山羊酸奶的质地均匀、流畅及黏稠, 而骆驼酸奶的组织结构脆弱, 持水性较差。有文献也发现骆驼酸奶的凝乳状态不理想, 具有水状的稠度[26]。骆驼酸奶中较大的酪蛋白胶束、β-乳球蛋白的缺乏及乳中脂肪球过小等导致了骆驼酸奶的质地不佳[13]。因此, 酸牛乳的流变学特性整体要优于山羊酸奶和骆驼酸奶。

3 结论

通过理化指标、主要物质与氨基酸含量、挥发性香气成分、全质构与流变学特性, 总结得出3种酸奶的品质的差异如下：酸牛乳中各类挥发性风味物质间组成合理, 具有典型的发酵酸奶的风味, 且内部结构稳定, 表现类固体特性；山羊酸奶的持水力和脂肪含量高, 挥发性代谢物以酸类物质为主, 羊膻味突出, 结构稳定性次于酸牛乳；骆驼酸奶具有高活菌数、抗氧化活性, 粗蛋白和半胱氨酸含量高, 具有典型发酵驼奶的风味, 整体质地较为脆弱。3种酸乳间品质的比较研究, 有助于满足不同人群的需求, 丰富乳制品的种类, 进而合理发展我国特种乳资源。