褪黑素干预对延缓大鼠运动疲劳发生的作用研究

赵梦迪，赵文革

褪黑素为哺乳动物分泌的一种吲哚类激素，在位于间脑脑前丘和丘脑之间的松果体中由色氨酸经羟化、脱羧、乙酰化及甲基化步骤合成[1]。褪黑素的合成与分泌活动与光暗环境有关，光照环境会抑制褪黑素的合成及分泌，而黑暗环境则相反，通常凌晨2-3点时褪黑素的分泌量达到顶峰[2]。褪黑素具有多种对人体有益的生理功能，如清除与人体衰老直接相关的自由基以延缓衰老；发挥抗氧化作用以抑制肿瘤细胞的增殖；激活免疫细胞的增殖以调节免疫；调节生物节律以改善睡眠等[3]。因此，维持正常作息、避免夜晚时处于光照的环境对于维持正常的生物节律十分关键。褪黑素与运动的关系十分密切，对于有睡眠障碍及运动损伤的运动员，褪黑素都有很好的调节及促进恢复作用。

运动疲劳是指由于机体运动时间过长或强度过大而引起的机体无法维持原运动强度从而致使身体机能下降的一种生理现象，这种运动疲劳也称为中枢运动疲劳[4]。运动疲劳是运动训练和康复领域的研究重点，通常将运动疲劳机制总结为四大理论体系，包括中枢疲劳理论、外周疲劳理论、神经-肌肉接点疲劳理论与综合性运动疲劳理论[5]，其中研究较为深入的为中枢疲劳理论和外周疲劳理论，中枢疲劳理论是指中枢神经系统发出抑制信号使身体运动能力下降从而保护机体免受损伤；外周疲劳理论是指因肌肉组织代谢产物堆积而引起肌肉疲劳，无论是中枢疲劳还是外周疲劳均会引起机体运动能力的下降。提高机体运动能力、缓解疲劳的发生是运动训练与康复领域研究的核心问题，为提出行之有效的方法，专家学者们从多个方面深入探究造成运动疲劳产生的因素[6]，主要包括神经递质失衡、自由基堆积、乳酸代谢堆积、支链氨基酸浓度降低等[7]。其中，神经递质失衡与自由基堆积被认为是运动疲劳发生中较为重要的因素，因此，缓解运动疲劳的研究多基于此。

当中枢神经系统出现保护性抑制时，神经递质会降低神经系统的兴奋性，主要表现为神经递质失衡，从而加快运动疲劳的发生。研究表明褪黑素可能会对机体的神经递质的含量存在的影响，即通过影响神经递质的动态平衡以调控神经系统的兴奋性[8-9]，但其对神经递质的具体影响研究不足。此外，褪黑素还会作为细胞内的自由基清除剂以防止或延缓运动疲劳的发生，主要包括清除超氧化物阴离子、游离氧分子、过氧化氢阴离子等[10]。本文就褪黑素如何影响运动疲劳的发生及其机制进行探究。

1 材料和方法

1.1 实验动物

成年雄性SD大鼠30只，体重170g～200g之间(购自北京维通利华实验动物公司)。大鼠正常分组(3只/笼)，成年雄性SD大鼠饲养于首都师范大学实验动物中心大鼠饲养房，自由饮水，饮食，温度为18～24℃，空气相对湿度40%～60%，正常昼夜节律。

1.2 实验方法

1.2.1 褪黑素处理

动物分组及给药：将30只SD大鼠随机平均分配为2组(N=15)：实验组与对照组。实验组：将20mg褪黑素先溶于0.5mL的无水乙醇中，取0.5mL上述溶液加入100mL的去离子水溶解饲喂大鼠，即饮用水中含有200μg/mL褪黑素；对照组：采用含有0.5mL无水乙醇的去离子水饲喂，其余条件均相同。

1.2.2 一次性力竭疲劳模型的建立

实验组与对照组大鼠在饲喂21天后，将两组大鼠应用平板跑台一次性力竭跑步模型处理，即大鼠每天测试前需进行适应性跑台训练(1次/天，共3天)，该运动强度低于力竭运动强度，待大鼠恢复2天后进行一次性力竭跑步实验，即treadmill平板跑台法，基本流程为：跑步时速：15cm/s，时间：15min；随后，跑步时速：25cm/s，时间：15min；最后跑步时速保持在35cm/s直至力竭并记录最终运动力竭时间。

1.2.3 脑内神经递质检测

两组大鼠力竭跑步实验结束后，采用断头法获取脑组织，置于冰上并迅速分离皮质、下丘脑、海马、纹状体。取部分样品采用高氯酸提取法充分匀浆后，4000g/min离心5min，离心取上清液，-80℃冻存，采用高效液相色谱法分析各部分脑组织内NE、DA、5-HT和DOPAC的含量。

1.3 统计分析

所有结果采用均数±标准差表示，组间差异采用t检验分析，P<0.05为显著性差异，P<0.01为极显著性差异。

2 实验结果

2.1 一次性力竭跑步时间

两组大鼠经一次性力竭运动后，测定最终运动力竭时间，结果显示褪黑素处理组较对照组跑步持续时间明显延长，力竭出现时间明显延后。褪黑素处理组大鼠跑步力竭时间为232.39±34.38min，对照组跑步力竭时间为187.17±21.08min(P<0.01)。

2.2 神经递质的检测

2.2.1 褪黑素处理对NE的影响

在对照组中NE的相对含量为4058.99±955.15，褪黑素处理组为8401.52±2581.32，褪黑素处理后，NE含量较对照组显著升高(P<0.05)。

图1 运动力竭时间

2.2.2 褪黑素处理对DA的影响

在对照组中DA的相对含量为3.95±1.84，褪黑素处理组为7.56±2.80，褪黑素处理后，DA含量显著提于对照组(P<0.05)。

图3 DA相对含量

2.2.3 褪黑素处理对5-HT的影响

在对照组中5-HT的相对含量为366.22±95.33，褪黑素处理组为131.75±66.51，褪黑素处理后，5-HT含量显著降低(P<0.05)。

图4 5-HT相对含量

2.2.4 褪黑素处理对DOPAC的影响

在对照组中DOPAC相对含量为37.56±27.39，褪黑素处理组为59.49±16.49，两组DOPAC含量无显著性差异(P>0.05)。

图5 DOPAC相对含量

3 分析及讨论

3.1 褪黑素处理延长运动时间

实验表明，褪黑素处理会显著延长SD大鼠的运动时间。这与其他文献中的报道一致，如大鼠的负重游泳实验中，褪黑素的应用明显延长了大鼠的游泳时间[11]，研究表明这与中枢神经系统的兴奋性相关。兴奋性神经递质与抑制性神经递质以及神经递质和受体之间存在动态平衡，当机体经过一段时间特定强度的运动后，神经递质的失衡会导致运动疲劳的发生，相关的神经递质包括多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)、5-羟色胺(5-HT)、乙酰胆碱(Ach)、谷氨酸(GA)等。因此，本实验将NE、DA、5-HT、DOPAC作为检测目标，分析褪黑素处理延缓运动疲劳发生的机制。

3.2 褪黑素处理对神经递质的影响

3.2.1 多巴胺结果分析

多巴胺是神经系统中调节机体运动的重要神经递质，由酪氨酸经转化而来，重要的代谢产物包括去甲肾上腺素和二羟苯乙酸[13]。因此多巴胺代谢水平的高低直接影响到其他被检测的神经递质的含量，与本实验结果相对应，去甲肾上腺素的含量与多巴胺的含量变化趋势一致。多巴胺与运动的关系一直是运动领域的研究热点。多项研究表明，当机体运动时，DA及其代谢产物NE浓度均升高[14-15]。这与其作用相关，即DA与NE会提高神经系统兴奋、增强肌肉协调、升高血糖供给能量等，这在机体运动中发挥了重要的作用。实验结果发现，与对照组相比，实验组中褪黑素处理导致的多巴胺的含量显著升高，这说明褪黑素可能通过提高多巴胺的含量提高运动能力，延长运动时间。

3.2.2 去甲肾上腺素结果分析

去甲肾上腺素作为机体中一种重要的兴奋性神经递质和升血糖激素，在运动过程中会提高神经系统的兴奋性以提高运动能力，延长运动时间，除此之外，去甲肾上腺素会提高血糖的含量以提供机体运动所需能量[16]。

去甲肾上腺素由多巴胺转化而来，其含量的高低受到多巴胺代谢的影响。同时，去甲肾上腺素又是褪黑素合成的原料，代谢水平的高低直接影响褪黑素的合成。在本实验中，褪黑素对大鼠的处理使其去甲肾上腺素含量显著升高，可能是由于机体内褪黑素含量升高导致的后续代谢产物对去甲肾上腺素的合成存在影响，这刺激了去甲肾上腺素的合成。褪黑素通过影响多巴胺、去甲肾上腺素发挥作用，促使中枢神经持续兴奋从而延缓了神经系统的疲劳。

3.2.3 5-羟色胺结果分析

5-羟色胺是衡量运动疲劳的标志性神经递质，实验结果显示褪黑素处理组中5-羟色胺的含量显著低于对照组。5-羟色胺作为运动研究领域的“明星分子”，关于其在运动系统中的作用及机制的研究较为广泛且深入。研究显示，由于血脑屏障的存在，5-羟色胺只能在脑内合成，当运动一段时间后，随着运动疲劳的出现，血液中游离氨基酸含量上升并与色氨酸竞争受体位点，这使得游离色氨酸含量增加进而进入脑内，导致脑内5-羟色胺合成含量的升高[17]。脑内5-羟色胺含量的增加会使得大脑皮层抑制性加强，降低多种酶的活性，减少ATP的合成量，致使机体运动能力降低[18]。采用褪黑素处理大鼠可能通过抑制脑内5-羟色胺的含量从而导致大脑皮层的兴奋性增强，进而延缓了运动疲劳的发生。

3.2.4 3,4-二羟苯乙酸结果分析

3,4-二羟苯乙酸作为多巴胺的代谢产物在运动领域中的研究较少。我们的实验检测发现褪黑素处理并没有改变3,4-二羟苯乙酸的含量，推测3,4-二羟苯乙酸并不参与运动疲劳的延缓，因此褪黑素处理延缓运动疲劳的发生与神经递质3,4-二羟苯乙酸无关。

3.3 褪黑素通过改善神经递质失衡延缓运动疲劳的机制推测

前期的实验发现，大鼠在负重游泳实验中，褪黑素处理组中血清乳酸脱氢酶的活性显著高于对照组[11]，同时，褪黑素处理会降低热应激小鼠的氧化损伤[12]，这表明褪黑素具有清除自由基及抗氧化的作用。褪黑素极易穿过血脑屏障进入神经细胞，并在其中发挥强大的自由基清除作用，同时可以减轻自由基导致的线粒体损伤和肿胀，这就让褪黑素成为了神经的保护剂，产生了抗兴奋作用[19]。在机体运动初期，兴奋性神经递质DA、NE浓度升高，随着特定强度下运动时间的延长，中枢神经系统为了保护机体免受损伤而产生抑制信号，出现运动疲劳，DA、NE浓度下降，抑制性神经递质5-HT浓度升高。本次实验采用褪黑素处理时，褪黑素可能穿过血脑屏障对中枢神经起到保护作用进而促进了DA、NE含量的增加，抑制了5-HT的浓度，延缓了运动疲劳的发生。

神经细胞中天冬氨酸为兴奋性神经递质，γ氨基丁酸为抑制性神经递质。小鼠经褪黑素灌胃后测定天冬氨酸、γ-氨基丁酸呈现昼夜节律变化，γ氨基丁酸含量升高[20]。当机体发生运动疲劳时，褪黑素处理导致的γ氨基丁酸升高会导致中枢抑制作用进而对运动疲劳也有很好的调节作用[21-22]。这也可能是褪黑素发挥作用的潜在机制。

4 结论

1.通过力竭运动模型发现，褪黑素处理组SD大鼠的最终力竭运动时间显著高于对照组，表明褪黑素处理可以显著延缓运动疲劳的发生。

2.在SD大鼠的力竭运动模型中，褪黑素处理显著提高了兴奋性神经递质去甲肾上腺素、多巴胺的含量，降低了抑制性神经递质5-羟色胺的含量，因此推测褪黑素延缓SD大鼠运动疲劳发生的机制为：提高兴奋性神经递质的含量，降低抑制性神经递质含量来维持中枢神经系统的兴奋性，改善因长时间或高强度运动而产生的神经递质失衡，这可能通过褪黑素本身具有的自由基清除及抗氧化作用提高了大鼠的运动能力以此延缓了运动力竭出现的时间。