猫传染性腹膜炎病毒PL1蛋白抑制宿主细胞IFN-β产生机制的研究

蔡冬冬，张 辉，王正义，罗 毅，刘伽均，李 春，胡晓亮，田志革*

（1.四川省动物疫病预防控制中心，四川 成都 610041；2.宜宾学院农林与食品工程学部，动物多样性与生态保育宜宾市重点实验室，四川 宜宾 644000）

1 材料与方法

1.1 细胞、毒株和质粒 FIPV DF2株、仙台病毒（Sendai virus，SeV）、萤火虫荧光素酶报告质粒、转录因子PRDⅢ/Ⅰ、NF-κB 和AP-1 报告质粒、RIG-1、MAVS、STING和TBK-1，均由中国农科院哈尔滨兽医研究所提供；CRFK细胞、空载体质粒p3×flag和pUb由“动物多样性与生态保育宜宾市重点实验室”保存；大肠杆菌感受态Trans5α购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 主要试剂 鼠抗flag 单抗、兔抗GAPDH 单抗、抗IRF3-S396、抗IRF3 抗体，均购于Sigma 公司；质粒提取试剂盒，购于AXYGEN公司；胶回收纯化试剂盒，购于OMEGA 公司；双荧光素酶报告系统试剂盒，购自Promega 公司；DMEM 细胞培养基，购于Hyclone 公司；胎牛血清，购自Hyclone公司；胰酶，购于Gibco BRL公司；脂质体Lipofectamine 2000 转染试剂，购于Invitrogen 公司；Tween-20、30%聚丙烯酰胺等试剂，购于索莱宝公司；PVDF 膜，购自Millipore 公司；RAPI 裂解液，购自碧云天公司。

1.3 FIPV PL1 基因的PCR 扩增 根据FIPV DF2 株（GenBank 登录号：JQ408981）的PL1 基因（3566-4355位点），使用Oligo软件设计1对引物，上游引物：5′-TTTAAGCTTTCCTTGACCCCATTCA AGACA-3′，下游引物：5′-TTTGAATTCTTAATCT TTAGGACTTTGACAGTC-3′，预期扩增产物长度为792 bp。

1.4 PL1 蛋白抑制宿主细胞产生IFN-β的机制研究 转染前一天，将CRFK 细胞均匀铺于24孔板中，待细胞长成单层且密度达到80%左右进行转染。转染体系中有1 μg PL1及其突变体质粒，300 μL DMEM 无血清培养液，3 μL 转染试剂，10 ng RL-TK 内参质粒。依据试验目的，分别另向体系中加入600 ng IFN-β-Luc、NF-κB-Luc、PRD Ⅲ/Ⅰ-Luc或AP-1-luc报告质粒，每个试验重复3次，同时设置空载体对照。转染24 h后，每孔加入100 HAU的SeV，12 h后弃去上清，用裂解液将细胞裂解10 min，8 000 r/min 离心5 min 后取20 μL裂解液进行荧光素酶活性测定。

1.5 激光共聚焦试验 将293T细胞接种到激光共聚焦小皿中培养过夜。将PL1 蛋白与空载体p-flag 共转染293T 细胞，转染24 h 后，弃培养基，PBS洗涤2次后，用4%多聚甲醛室温固定30 min，并用0.1% TritonX-100 透膜15 min，用5%脱脂乳封闭1 h 后，加入抗IRF3 和抗IRF3-S396 抗体（1∶1 000）稀释，37 ℃孵育1 h，用PBS洗涤3次，分别加入抗兔和抗人抗体作为二抗，在37℃孵育1h，随后用PBS 洗涤3 次，DAPI 染色15 min，洗涤3次，最后置于激光共聚焦显微镜下观察。

1.6 免疫印迹试验 将PL1 蛋白与p-flag 载体分别与pUb 载体共转染293T 细胞后，接种SeV（100 HAU）12 h 后，收集细胞裂解液，经过13 000 r/min离心5 min后取上清，进行SDS-PAGE电泳，转膜，37 ℃封闭2 h，分别加入抗IRF3、抗IRF3-S396 抗体（1∶1 000）和HA 抗体（1∶3 000）后，加入抗兔和抗人抗体作为二抗，进行免疫印迹检测。

2 结果

2.1 PL1 蛋白抑制IFN-β启动子活性 为验证PL1 蛋白能否抑制IFN-β启动子的激活，将PL1与IFN-β启动子共转染CRFK 细胞，结果显示PL1 能够抑制SeV 诱导的INF-β启动子的激活（图1-A）。但是INF-β启动子含有3种转录因子PRDⅢ/Ⅰ、NF-κB 和AP-1，为进一步确定PL1 蛋白抑制哪一种转录因子，将PL1 蛋白与3 种转录因子启动子载体共转染，转染24 h后加入SeV，采用上述方法处理细胞后，检测荧光素酶强度。结果表明PL1蛋白能够抑制全部3种转录因子并且呈剂量依赖性（图1-B、C、D）。说明PL1 蛋白具有抑制IFN-β启动子的能力，并且能够抑制3 种转录因子启动子的活性。

图1 PL1蛋白抑制IFN-β启动子活性

2.2 PL1 蛋白抑制IRF3 磷酸化 为了验证PL1是否影响IRF3的磷酸化，将PL1转染293T后，分别接种SeV（HA＝100），24 h 后分别进行Western blotting实验检测，结果与SeV诱导后相比，PL1蛋白能够明显下调IRF3的磷酸化（图2）。

图2 PL1抑制IRF3磷酸化

2.3 PL1 依赖催化活性抑制IFN-β的表达 为了确定PL1介导的抑制IFN-β表达是否依赖其催化活性，将PL1 突变体（C32A、H183A 和D196A）与RIG-1、MAVS、STING和TBK-1、IFN-β-Luc和pRL-TK 共转染293T 后，接种SeV，24 h 后检测Luciferase值。结果表明：与PL1相比，PL1的突变体（C32A 和H183A）几乎完全丧失对抗IFN-β启动子活性的能力，而D196A 仅仅有部分抑制活性。基于此，我们确认PL1蛋白抑制IFN-β启动子的活性需要被催化。PL1 能够分别抑制RIG-1、MAVS、STING 和TBK-1 诱导的IFN-β 的激活（图3）。

图3 FIPV PL1突变体与IFN-β-Luc的关系

2.4 PL1 利用DUB 活性降低Ub 的泛素化 上述试验证明PL1 蛋白能抑制IFN-β启动子活性，而PL1 突变体不具有其活性，PL1 的催化活性区域负责蛋白的去泛素化，这说明PL1 蛋白可能依赖于其蛋白酶活性。我们通过Western blotting实验证明PL1 蛋白具有去泛素化活性，而PL1 的突变体并不存在去泛素化活性（图4）。

图4 PL1蛋白的去泛素化活性

3 讨论

CoV-NL63 的PL 和SARS-CoV 的PL 既能通过抑制IRF-3 的磷酸化和核转移阻断IFN 的合成，又能抑制STING 介导的IFN-3 的核转移［1］。细胞中表达野生型和催化突变PL2-TM能够降低STING、RIG-1、TBK-1和IRF-3的泛素化水平，这些都可能影响IFN诱导的信号转导。MHV的PL2明显抑制CARDIF、TBK-1和IRF-3介导的IFN-β启动子激活，还能与IRF-3 结合抑制其核转移利用其去泛素化活性［2］。PEDV 的PL2 和TGEV 的PL1作为病毒的去泛素化酶干扰RIG-1和STING介导的信号转导［3］。冠状病毒利用PL 的酶活性逃避宿主固有免疫抗病毒反应。FIPV PL1 具有与TGEV PL1 相似的结构，后者具有去泛素化酶活性，因此推测FIPV PL1 也可能有此活性和功能。本研究发现FIPV PL1 抑制IFN-β启动子的表达和IRF-3的移核通过其催化活性区。

泛素化和去泛素化是病毒诱导的Ⅰ型IFN信号通路的重要调节方式［4］。RIG-1 通过E3 泛素化连接酶（TRIM25），引起下游Ⅰ型IFNs 的信号表达盒［5］。很多病毒具有去泛素化酶活性，比如口蹄疫病毒的Lpro［6］，人巨细胞病毒的UL48［7］，单纯疱疹病毒的UL36［8］和猪繁殖与呼吸合征病毒的nsp2 蛋白［9］。所有的冠状病毒都编码去泛素化酶，这可能会调节固有免疫应答。本研究发现FIPV PL1 的3 个催化活性中心的突变能够使去泛素化作用失活，不能抑制病毒诱导的IFN-β的激活，说明FIPV PL1 的去泛素化作用直接涉及Ⅰ型干扰素的抑制作用。