在线固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法同时检测污水中氟胺酮等21种毒品及其代谢物

2022-10-28乔宏伟张婷婷花镇东杭太俊刘培培

中国司法鉴定 2022年5期

丁艳，乔宏伟，陈捷，张婷婷，花镇东，杭太俊，刘培培

（1.中国药科大学药学院，江苏南京 210009；2.公安部禁毒情报技术中心毒品监测管控与禁毒关键技术公安部重点实验室，北京 100193；3.“国家禁毒委员会办公室-中国药科大学”禁毒关键技术联合实验室，北京 100193）

毒品滥用问题在全球各国蔓延，严重危害人类健康，已成为当今国际社会所需要面对的共同问题。联合国毒品和犯罪问题办公室（The United Nations Office on Drugs and Crimes，UNODC）2021年度毒品报告显示，2020年全球吸毒人数达2.74亿，相比2019年增加了22%。近十年内，毒品种类大幅增加，除了传统的可卡因、海洛因等植物源毒品外，毒品消费市场上出现了大量新型合成毒品，特别是未管制的新精神活性物质。毒品滥用日益隐蔽，发现打击毒品滥用及犯罪更加困难，对各国政府治理毒品滥用问题提出了新的挑战。

我国国家禁毒委员会办公室（以下简称“国家禁毒办”）发布的《2019年中国毒品形势报告》中指出，我国吸毒人员滥用的毒品种类主要有冰毒、海洛因和氯胺酮等，可卡因、大麻、摇头丸也有少量滥用。近年来，毒品消费市场上不断出现新型毒品，如氯胺酮的氟代衍生物氟胺酮（Fluoroketamine，2-FDCK），俗称“改良K粉”，目前无合法的医疗用途，吸食后可产生与氯胺酮类似的麻醉、分离和致幻效果。2021年5月11日，我国发布《关于将合成大麻素类物质和氟胺酮等18种物质列入〈非药用类麻醉药品和精神药品管制品种增补目录〉的公告》，正式对氟胺酮进行列管，自2021年7月1日起施行。目前，关于氟胺酮的相关研究还相对较少，如何发现、打击氟胺酮的非法制造、滥用也是执法部门所面临的难题。

为应对新型毒品更新迭代速度不断加快的毒情形势，对毒品滥用种类、滥用规模、变化趋势等进行动态监测已成为各国禁毒部门的重要手段。相较于传统的问卷调查、毒品查缉、执法打击等手段，污水分析法能够更加客观、及时、准确地反映毒品滥用形势。污水监测又称为污水流行病学（Wastewater-Based Epidemiology,WBE），于2001年首次由美国的DAUGHTON等提出，是基于人服用药物后，药物的活性成分及其代谢产物会通过尿液和粪便排入城市排水系统中。该方法通过测定污水中的目标化合物和代谢产物的含量，计算出污水处理厂所覆盖人口的日平均毒品消耗量，能够更加快速、准确监测该区域内的毒品滥用种类及规模，不但能为打击非法制贩毒品、吸毒违法活动提供准确情报，还可为下一步国家管制新品种的毒品提供科学、客观的数据支撑。

目前，各国的污水监测除有少量文献采用液-液萃取法（Liquid-Liquid Extraction，LLE）进行污水前处理外，大部分都采用离线固相萃取（Offline Solid Phase Extraction，Offline-SPE）作为污水的前处理方式。前处理过程包括过滤、调节pH值、固相萃取、淋洗、洗脱、浓缩和复溶等多个环节，处理样品耗时较长，所需样品量大，且前处理过程多数为开放式，容易引入外部污染，干扰检测结果。在线固相萃取法（Online SPE）因其所需样品量少、前处理简便、分析时间短、使用溶剂少等优点被广泛应用于环境监测及毒品滥用监测。本文拟采用一种在线固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法（Online Solid Phase Extraction-Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，Online-SPEUPLC-MS/MS）同时检测污水中氟胺酮等21种毒品及其代谢物的定性、定量方法，以期更好地应用于国内各城市生活污水的检测。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

ACQUITY UPLC H-Class型超高效液相色谱仪；Waters Xevo TQ-XS型串联质谱仪；Waters 2777C型在线固相萃取系统；玻璃纤维滤膜（1.2 μm，直径47mm，英国Whatman公司）；再生纤维素滤膜（0.2μm，直径25 mm，美国Agilent公司）。

吗啡（Morphine，MOR）、MOR-D、甲基苯丙胺（Methamphetamine，MA）、MA-D、苯丙胺（Amphetamine，AM）、AM-D、氯胺酮（Ketamine，KET）、KET-D、去甲氯胺酮（Norketamine，NK）、NK-D、3，4-亚甲二氧基甲基苯丙胺（Methylenedioxymethamphetamine，MDMA）、MDMA-D、3,4-亚甲二氧基苯丙胺（Methylenedioxymphetamine，MDA）、MDA-D、苯甲酰爱康宁（Benzoylecgonine，BZE）、BZE-D、芬太尼（Fentanyl，FEN）、FEN-D、去苯乙基芬太尼（Norfentanyl，NFN）、NFN-D、舒芬太尼（Sufentanil，SUF）、SUF-D、去苯乙基乙酰芬太尼（Noracefentanyl，NAF）、NAF-C、可待因（Codeine，COD）、COD-D、曲马多（Tramadol，TRD）、TRD-D、美沙酮（Methadone，MTD）、MTD-D、2-亚乙基-1,5-二甲基-3,3-二苯基吡咯烷（2-ethylidene-1,5-dimethyl-3,3-diphenylpyrrolidine,EDDP）、EDDPD标准物质甲醇溶液（美国Cerilliant公司），质量浓度为1 mg/mL或0.1 mg/mL；O-单乙酰吗啡（6-Monoacetylmorphine，6-MAM）、6-MAM-D、可卡因（Cocaine，COC）、COC-D标准物质乙腈溶液（美国Cerilliant公司），质量浓度为1 mg/mL或0.1 mg/mL；氟胺酮（Fluoroketamine、2-FDCK）、2-FDCK-D、去甲氟胺酮（Norfluoroketamine,NFK）、NFK-D、4-甲氧基甲基苯丙胺（p-Methoxymethamphetamine,PMMA）、PMMA-D标准物质（上海市刑事科学技术研究院）；甲醇、乙腈、异丙醇均为色谱纯（德国Merck公司）；甲酸为色谱纯（德国Honeywell公司）；乙酸胺为分析纯（美国Sigma-Aldrich公司）；氨水为分析纯（德国CNW公司）；浓盐酸为分析纯（德国CNW公司）；实验用水为由Milli-Q（德国Merck公司）纯水机制备的纯水。

实验采用24 h连续采样方式收集了来自全国31个省（区、市）污水处理厂的1 600份污水样品。

混合标准物质工作溶液：25 ng/L，分别移取21种目标物标准物质储备溶液适量，用甲醇稀释配制成质量浓度为25ng/L的混合标准物质工作溶液。

混合同位素内标工作溶液：5ng/L，分别移取21种目标物的同位素内标储备溶液适量，用甲醇稀释配制成质量浓度为5ng/L的混合同位素内标工作溶液。

标准曲线工作溶液系列：分别移取质量浓度为25ng/L的混合标准溶液适量，用甲醇逐级稀释，配置成质量浓度为0.01~20ng/L的标准曲线工作溶液系列。

1.2 方法

1.2.1 仪器工作条件

在线固相萃取过程Oasis○HLB Direct Connect HP固相萃取柱（2.1 mm×30 mm，20 μm）；在线固相萃取系统配置自动进样器（进样量为0.1~5 mL）、低压四元泵（配备两根Oasis R○HLB Direct Connect HP固相萃取柱）、高压二元泵（配备一根Waters ACQUITY UPLC HSS T色谱柱）、柱温箱。进样器吸取样品后，当时间为0~3.8 min时，四元泵流动相用1号固相萃取柱对样品进行浓缩；当时间为3.8 min时，降流速切六通阀；当时间为3.8~15.0 min时，二元泵流动相将目标物从1号固相萃取柱上反相洗脱并加载至色谱柱中分离，同时四元泵流动相对2号固相萃取柱进行活化，两根固相萃取柱交替使用对污水样品中的目标物进行固相萃取。

色谱条件Waters ACQUITY UPLC HSS T色谱柱（100 mm×2.1 mm,1.8 μm）；柱温为40℃；进样量为1000 μL；四元泵流动相A为纯水，B为体积比为1∶1∶1的甲醇-乙腈-异丙醇溶液；二元泵流动相A为0.1%（体积分数，下同）甲酸水溶液，B为0.1%甲酸-乙腈溶液。四元泵在线固相萃取条件见表1，二元泵梯度洗脱条件见表2。

表1 四元泵在线固相萃取条件

表2 二元泵梯度洗脱条件

质谱条件电喷雾离子源正离子模式（Electron Spray Ionization，ESI）；毛细管电压为1.0 kV；脱溶剂（N）温度为500℃，流速为1 000 L/h；锥孔气流速为150 L/h；碰撞气为氩气，多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）模式。21种目标物的质谱参数及保留时间见表3。

表3 21种目标物及其同位素内标的质谱参数与保留时间

续表3

1.2.2 样品处理过程

样品在-20℃条件下冷冻保存，分析时解冻并充分摇匀，用玻璃纤维滤膜过滤，移取滤液10 mL于具盖离心管中，每份样品平行取两份。加入适量10%（体积分数，下同）氨水溶液，将样品pH值调至7~8，分别加入4 mol/L乙酸铵溶液和混合同位素内标工作溶液各100 μL，混合均匀，用再生纤维素滤膜过滤后，在仪器工作条件下进行测定。

2 结果与讨论

2.1 实验条件的优化

2.1.1 色谱柱

实验对ACQUITY UPLC HSS T色谱柱（2.1mm×100 mm，1.8 μm；以下简称为“色谱柱1”）、ACQUITY UPLC HSS C色谱柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm；以下简称为“色谱柱2”）、ACQUITY UPLC BEH C色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm；以下简称为“色谱柱3”）这3种不同色谱柱的柱效进行考察。结果表明：色谱柱2的柱长较长，分离目标物所需的洗脱时间更长，且柱温需要升至50°C，才能使柱压在合理范围内；色谱柱3因填料为亚乙基桥杂化颗粒，色谱柱3因填料为亚乙基桥杂化颗粒，初始流动相至少需要5%的有机相与水相混合，在该梯度下，MOR等部分目标物出峰时间会小于死时间；色谱柱1填料为高强度硅胶颗粒，可用100%水相作为流动相，各目标物分离度及峰形最佳，适用于污水中毒品及其代谢物的检测。因此，实验选择ACQUITY UPLC HSS T色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）。质量浓度为50 ng/L的21种目标物的色谱图见图1。

图1 21种目标物的色谱图（质量浓度为50 ng/L）

2.1.2在线固相萃取流动相

实验对分别以纯水、5%氨水溶液作为在线固相萃取的流动相A进行了考察。结果表明：以5%氨水溶液为流动相A时，目标物COC和BZE重复性较差；以纯水作为流动相A时，各目标物的萃取效果较佳。因此，实验选择以纯水作为在线固相萃取的流动相A。

实验进一步对分别以乙腈、甲醇、体积比为1∶1∶1的甲醇-乙腈-异丙醇溶液作为在线固相萃取的流动相B进行了考察。结果表明：以体积比为1∶1∶1的甲醇-乙腈-异丙醇溶液为流动相B时，对各目标物的洗脱能力最强，清洗固相萃取小柱的效果最佳，可延长固相萃取小柱使用寿命。因此，实验选择以体积比为1∶1∶1的甲醇-乙腈-异丙醇溶液作为在线固相萃取的流动相B。

2.1.3 样品前处理条件

2.1.3.1 样品pH值

实验考察了样品pH值对目标物检测的影响，选取6个不同基质的污水样品，分别对每个样品添加混合标准溶液，配制成目标物质量浓度为50 ng/L的5份样品，分别通过添加浓盐酸或10%氨水溶液将每种基质样品的pH值分别调节为5、6、7、8、9，平行处理所有样品后进行分析，6种目标物在不同pH值下的色谱图如图2所示。实验结果表明：NFK、6-MAM、MOR、MA、AM和COD这6种目标物的峰形和峰强度受pH值影响较大，当污水偏酸性时，6种目标物的峰形最差；当污水pH值为7~8时，6种目标物的的峰形最佳，峰强度最大。因此，实验对样品进行前处理时，通过添加适量10%氨水溶液将污水pH值调节至7~8。

图2 NFK、MOR、6-MAM、MA、AM和COD在不同pH值条件下的色谱图

2.1.3.2 样品中添加的缓冲盐

实验考察了不添加缓冲盐、添加4 mol/L乙酸铵溶液、添加4 mol/L甲酸铵溶液对目标物检测的影响。分别选取6个不同基质的污水，对每个样品添加混合标准溶液，配制成目标物质量浓度为50 ng/L的3份样品。结果表明，添加4 mol/L乙酸铵溶液时，目标物的响应最佳，且峰强度最大。

2.1.3.3 污水基质

实验分别考察了生活饮用水及9个不同地区的生活污水共10种污水基质对目标物检测的影响。分别将10种基质配制成所有目标物及其同位素内标质量浓度均为50ng/L的添加样品，对比21种目标物及其同位素内标的响应和峰面积。结果表明：目标物在生活饮用水中的响应最佳，污水基质对目标物的测定影响较大，如生活污水中6-MAM、MA、KET的定量离子对的峰面积分别为生活饮用水中峰面积的40%~85%、61%~95%、55%~78%。加入同位素内标后，基质效应可得到同步校正。用目标物定量离子对峰面积与同位素内标离子对峰面积的比值进行定量可以最大程度地降低基质对于定量结果的影响，如在不同污水基质中，6-MAM的比值为0.99~1.13，MA的比值为0.83~0.91，KET的比值为1.10~1.20。因此，对污水中的毒品及其代谢物进行定性、定量分析时，加入同位素内标是保证分析结果准确的必要条件。

2.2 方法学验证结果

2.2.1 线性方程、检出限与定量限

取若干份生活饮用水，分别添加不同质量浓度的标准溶液，配制9个不同质量浓度的污水样品，目标物质量浓度分别为1、2、5、10、20、50、100、150、200 ng/L，按照样品处理过程分析样品。每个质量浓度重复测定6次，以标准添加样品中目标物的质量浓度为横坐标（x），以标准添加样品中目标物定量离子对峰面积与相应同位素内标定量离子对峰面积的比值为纵坐标（y）进行线性回归（权重系数为1/x），得到线性回归方程。结果表明，MOR和6-MAM在2~200 ng/L范围内线性关系良好，其他目标物在1~200 ng/L范围内线性关系良好，具体结果见表4。

取若干份生活饮用水，分别添加不同质量浓度的标准溶液，配制成5个不同质量浓度的污水样品，目标物质量浓度分别为0.1、0.2、0.5、1、2 ng/L，按照样品处理过程分析样品。每个质量浓度重复测定10次，按欧盟定性评价标准进行判定，确认各质量浓度下的阳性检出率，以阳性率100%的最低质量浓度作为定性检出限。结果发现，除了MOR和6-MAM的检出限为1 ng/L外，其他目标物的检出限均为0.5 ng/L。

2.2.2 准确度、精密度与基质效应

取10种不同来源的空白基质，分别添加不同质量浓度的标准溶液，配制成低、中、高3种不同质量浓度的质控样品，目标物的添加质量浓度分别为0、2、50、150 ng/L，按照样品处理过程分析样品。每一质量浓度样品平行测定6次，采用内标法分别计算不同污水基质中各目标物的质量浓度，以计算质量浓度与添加质量浓度的比值作为准确度。连续测定3 d，求得各目标物在不同质量浓度下的平均日内、日间精密度。计算不同基质与生活饮用水中目标物的定量离子对峰面积比值得到外标法基质效应，其范围为17.27%~107.14%，平均值为57.47%。计算不同基质与生活饮用水中目标物和相应同位素内标的定量离子对峰面积比值得到内标法基质效应，其范围为77.70%~110.64%，平均值为91.30%，具体结果见表4。

表4 21种目标物的方法学验证数据

续表4

2.2.3 稳定性

取空白基质，分别添加不同质量浓度的标准溶液，配制成低、中、高3种不同质量浓度的质控样品，目标物的添加质量浓度分别为2、50、150 ng/L，按照样品处理过程分析样品。分别在室温、4℃条件下放置24、48h后，每一质量浓度样品平行测定2次。结果表明，21种目标物在室温、4℃条件下放置48 h后仍稳定存在，目标物的定量离子对峰面积变化范围小于10%。

2.2.4 残留效应

取空白基质，配制成标准曲线最高质量浓度点的样品，同时配制6份空白样品。先分析标准曲线最高点样品2次，再将空白样品分析6次。在该实验条件下，第2次空白样品中残留的各目标物定量离子对峰面积均低于其定量限峰面积的15%，这说明残留效应对污水中各目标物测定的影响均较小。

2.3 实际样品分析

本方法已应用于全国31个省（区、市）的污水处理厂中进水口污水样品的检测，实验选取了2021年上半年污水监测中具有代表性的31份污水样品进行测定，结果见表5。从表5可以看出：MA的检出率最高达97%，最高质量浓度为48.83 ng/L，低于前期国内文献报道的数值；MOR、COD、TRD的检出率次之，其检出率分别为94%、90%、71%，MOR、COD的最高质量浓度分别为58.75、42.84 ng/L，均低于欧洲各国文献报道的数值；MTD及其代谢物EDDP检出率均为26%，MDMA检出率为3%，PMMA、O-MOR、MDA、COC、BZE、FEN、NF、SUF、NAF均未检出。2021年在全国12个城市的污水中检出2-FDCK，其检出率39%高于KET（32%），2-FDCK的最高质量浓度为42.54 ng/L，大多数高于前期国内文献报道的数值，且其质量浓度以高于KET居多。2021年7月1日，我国新增列管氟胺酮后，其检出率明显下降。污水监测结果为我国新增列管氟胺酮提供了科学客观的依据，此外，从氟胺酮列管后的污水监测数据看，我国相关制造、贩卖、吸食等违法犯罪行为均得到明显遏制。