不同稀释液生理参数对关中奶山羊精液保存及冷冻效果的研究

王 广， 邹家浩， 张永涛， 李德娴， 袁宇欣， 余梦琦， 陈 璐， 陈 伟， 李 广*

(1.西北农林科技大学动物科技学院，奶羊产业技术创新实验室，陕西 杨凌 712100；2.陕西省榆林市定边县安边区域农牧兽医技术推广站，陕西 定边 718600)

精液冷冻保存技术的研究与利用，有利于动物遗传资源保护，可使精液不受时间、地域的限制，便于开展种畜资源共享和交流，提高优良种畜的利用率和延长公畜精子的使用时限。精液保存时，需要添加精液稀释液保护精子，尤其是在降温、冷冻解冻过程中，稀释液的成分可在一定程度上减轻低温对精子的损伤[1]，精子的长期保存效果与稀释液生理参数(渗透压和pH值)具有重要的关系。目前对于山羊冷冻精液的研究主要集中在稀释液的优化组合上，关于不同pH值、渗透压的稀释液对关中奶山羊精液品质及其冷冻效果的方面的研究较少。为此试验设置了不同pH值、渗透压的稀释液探究其对关中奶山羊精子质量的影响，从而为奶山羊精液的冷冻保存技术提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

关中奶山羊种公羊：选择陕西省三原县某种羊场3只1.5岁龄正常采精种公羊，平均年龄、膘情、体重等组间差异不显著(P>0.05)，饲养管理条件一致。

1.2 稀释液组成

基础配方第Ⅰ液：葡萄糖3.1 g、乳糖2.8 g、柠檬酸钠1.8 g、三羟基甲基氨基甲烷(Tris)0.01 g、柠檬酸0.028 g、双蒸水100 mL；第Ⅱ液：在第Ⅰ液基础上加青霉素10万单位、链霉素10万单位、甘油5 mL、卵黄20 mL。

1.3 试验设计

试验在基础液的基础上，pH值设计4个不同的处理组(A1、A2、A3、A4)，其pH值依次为6.7，7.0，7.3，7.6；渗透压设计4个不同的处理组(B1、B2、B3、B4)，其渗透压依次为△0.526 ℃，△0.682 ℃，△0.754 ℃，△0.893 ℃。

1.4 精液采集与处理

运用假阴道法采集3只公羊的精液后，立即送至实验室，在38 ℃下通过显微检查，对精子样本进行精子密度和精子活力评估。精子形态正常，畸形率小于5%，精子活力在0.75以上，密度大于15亿/mL的精液可用于后续实验。将合格的精液用的稀释剂等温稀释，放入4 ℃冰箱冷藏2 h。第1次平衡完成后，在4 ℃操作台内进行第2次等温稀释，然后继续在4 ℃冰箱中平衡2 h。平衡完成后，将精液装入0.25 mL的细管中，按照特定的冷冻程序将温度从5 ℃降到-140 ℃。然后将细管浸入-196 ℃的液氮中以完成冷冻过程；解冻时将样品在38 ℃水浴中解冻35 s，取样进行精子检测。

1.5 精子品质检测

对降温前、平衡后与解冻后的精子的活率、复苏率、精子顶体完整率、精子畸形率及精子冻后存活时间等指标进行显微检测。

1.6 数据处理

试验数据采用Excel 2010软件进行分类统计，使用SPSS 26.0软件进行方差分析，独立样本t检验比较组间差异显著性。试验结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 不同pH值对关中奶山羊精液保存及冷冻效果的影响

2.1.1 不同pH值对关中奶山羊精子不同阶段活率比较 由表1可见，pH值为7.3时的为平衡后与解冻后的活率最高。

表1 不同pH值处理间精子不同阶段活率比较 %

2.1.2 不同pH值对关中奶山羊冻后活力、复苏率和解冻后顶体完整率比较 由表2可见，pH值为7.3时对精子的冻后活率、复苏率及解冻后顶体完整率有一定的影响，试验组A3的渗透压对精子的保护作用最好。

表2 不同pH值处理间对精子的冻后活力、复苏率和解冻后顶体完整率比较 %

2.1.3 不同pH值对不同阶段精子存活时间和解冻后保存效果的影响 由表3可见，不同pH值对精子存活时间和冻后室温存活时间有一定的差异，其中试验组A3冻后室温存活时间最长，冻后8 h活率最高。

表3 不同pH值对精子存活时间和冻后室温活率比较

2.2 不同渗透压对关中奶山羊精液保存及冷冻效果的影响

2.2.1 不同渗透压对关中奶山羊精子不同阶段活率比较 由表4可见，试验组B3的渗透压为△0.754 ℃时，精子平衡后与解冻后的活率最高。

表4 不同渗透压处理间精子不同阶段活率比较 %

2.2.2 不同渗透压对精子的冻后活力、复苏率和解冻后顶体完整率的影响 由表5可见，渗透压对精子的冻后活率、复苏率及解冻后顶体完整率有一定的影响，试验组B3的渗透压对精子的保护作用最好。

表5 不同渗透压对精子的冻后活力、复苏率和解冻后顶体完整率比较 %

2.2.3 不同渗透压对不同阶段精子存活时间和解冻后保存效果的影响 由表6可见，不同pH值对精子存活时间和冻后室温存活时间有一定的差异，其中试验组B3冻后室温存活时间最长。

表6 不同渗透压对精子存活时间和冻后室温活率比较

3 讨 论

在关中奶山羊细管冻精制作过程中，精子代谢很强烈，能量消耗快，同时代谢产物的积累也会改变环境pH，导致某些酶的活性被抑制，致使精子丧失受精能力，因此稀释液pH的控制很重要，精液的pH值可因精子代谢或其它原因而发生变化，当精液pH值降低时，精子的代谢活动减弱，反之，pH上升时，代谢活动增强，能量迅速耗竭，存活时间减少[2]。精液正常pH值是渗透压，酶系统，电离度趋于稳定水平的标志，pH值发生变化就意味着精液受到污染，代谢物积累时pH值降低，造成渗透压改变，电离度增高，加速精子死亡[3]。为了维持正常代谢活动，精子需要一个适宜的pH值[4]，本试验发现稀释液pH值在7.3时有较高的精子活力。本试验通过调节稀释液中pH值对关中奶山羊精液进行冷冻，发现不同pH值对精子活力影响较大，从试验结果来看，精液冷冻过后，pH值为7.3的试验组解冻活力较高，建议在制作冻精时稀释液的pH值应控制在7.3左右。此结论与祝发明等[5]对波尔山羊冻精的研究结果相似，最佳pH值应该控制在7.2～7.4.之间，但与Buckrell等[6]建议的羊冻精pH保持在6.8左右有所不同。目前，国内对羊冷冻精液pH值相关研究较少。马英玉等[7]建议羊冻精稀释液pH值应控制在6.8～7.2之间；丁瑜[8]认为pH值过高会影响冷冻精液的保存。当稀释液酸度增大时，精细胞膜表面的亲水基团的中心原子，便趋向于形成带正电荷的阳离子。随着阳离子半径的变小，有效核电荷数增大，亲水基团的水合作用加强，相应稳定了精细胞膜表面的结合水，在液相结冰水分子重组时，便可对精细胞膜起到保护作用[9]。本试验中基础液pH值7.3效果最好，这可能是由于精子在pH值6.6～6.8运动比较旺盛，能量消耗过快，导致平衡后、解冻后活力较低；另一方面是pH值的调整引起渗透压相应的变化，导致冻后活力和冻后顶体完整率受影响。从试验可见稀释液渗透压稍高对精液保存有利[10]。Tris(三羟甲基氨基甲烷)其pH缓冲范围在7～9，Tris能使精液的pH值在一定程度上倾向于碱性，从而有利于提高精子活力。多数稀释液的pH值为弱碱性，因为精液在保存过程中会产生酸性代谢产物，碱性稀释液能够中和一部分酸性物质，防止pH值过酸造成精子死亡[11]。在动物的生殖系统中，副性腺的分泌物为偏碱性，刚排出的精子是弱酸性，处于“休眠”状态，精子的弱酸性在阴道中被分泌物中和后，精子会解除休眠状态，活力增加[12]；分泌物是精子天然的缓冲液，可以抵抗阴道中的酸性物质，使精子在阴道内部运输、贮存时维持较好的活性和受精能力[13]。在本试验配方中添加了一定量的Tris液，精子的冻后活率及冻后室温保存8 h后活率较高；柠檬酸是一种有机酸，具有一定的缓冲作用，在机体内参与糖、脂肪和蛋白质代谢，在本试验配方中添加了一定量的柠檬酸，精子的冻后活率及冻后室温保存8 h后活率最高，这可能是羊原精中钠的含量较高[14]，精液中的钠与稀释液中柠檬酸结合，维持精液的pH值与渗透压，有利于提高活力。

精子的顶体是完成受精过程的重要细胞结构，顶体完整率越高，存活指数越大，精子的存活时间越长[15]。精子畸形率高，对受精能力的影响就大。稀释液的渗透压对精子的影响很大，过高和过低都会产生不良的影响。在一定范围内，精子对不同渗透压的稀释液有逐渐适应的能力，但精子对低渗比高渗较为敏感[15-17]。本试验中的精子稀释液渗透压为△0.754 ℃时，冻后精子顶体完整率最高、畸形率最低，所以，在配制稀释液时要特别注意稀释液的渗透压调整。