湖泊型藻类培养与致嗅物质产生的研究初探

于红玲， 郭茜楠， 韩 旭

(天津水务集团水质监测中心， 天津 300241)

随着水体富营养化情况的加剧，国内外很多区域报道湖泊、水库出现了藻类爆发的情况。目前世界各国对藻类相关代谢产物的研宄已经相当广泛和深入。藻类的次生代谢产物嗅味物质直接影响饮用水的感官性状，引起了越来越多人的关注。20世纪50年代末至今，已有二十多个国家先后报道了水体存在异味的问题并进行了相关研究。近年来，我国各地突发饮水污染事件频发，据调查其中很多和饮用水中藻类产生的异味相关[1]。同时，全球气候变暖和CO2浓度的增加也为蓝藻生长提供了有利条件，导致水体中蓝藻大量繁殖形成蓝藻水华， 影响了水域生态系统、旅游业及生态景观。更为严重的是，某些有害蓝藻分泌的毒素或致嗅物质会使饮用水水质恶化， 对居民饮用水安全构成威胁[2]。这其中以2-甲基异莰醇及土臭素最为常见。两者均为萜类化合物， 20 世纪 60 年代在放线菌中被发现[3]，其嗅阈值(OTC)较低，分别为15和10 ng/L。多种藻类也能产生这两种嗅味物质[4]。通常情况下，在藻类繁殖季节，我国部分湖泊、水库等部分水体中的2-甲基异莰醇及土臭素浓度会超过10 ng/L，因此，进行藻类计数、土臭素和2-甲基异莰醇的检测很重要[5]。

笔者结合近年来北方湖泊、水库中较为常见的藻类，选择了3种蓝藻，初步摸索了藻类培养条件，在保证藻类能正常培养、传代后，确定了藻类计数方法，搭建了致嗅物质的固相萃取-气相色谱/质谱联用仪快速检测方法，对藻类培养液开展检测，以期为进一步研究藻类与致嗅物质相关性、水中致嗅物质的去除等问题打下基础。

1 材料与方法

1.1 培养藻类

实验所选择的3种藻类的信息[6]见表1。

表1 3种藻类的基本信息

1.2 仪器和试剂

人工气候培养箱(bluepard)；生物显微镜(Olympus BX51)；气相色谱/质谱联用仪( GC-MS；Agilent 8890-5977A)，具备CTC自动进样器固相微萃取模块；气相相色谱柱：DB-5MS型毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；高压灭菌锅。

Milli-Q 超纯水，15 MΩ·cm；BG11培养基；土臭素、2-甲基异莰醇混标，100 μg/mL；2-异丁基-3-氧基吡嗪，1 000 μg/mL；氯化钠，500 g，优级，经450℃烘烤2 h后置干燥器内备用；高纯氦，纯度≥99.999%；移液枪。

藻种购置于中国科学院淡水藻种库。

1.3 人工气候培养箱培养条件

根据初步摸索，确定藻类培养条件见表2。

1.4 藻类传代与培养方式

1.4.1培养基配制

依据BG11培养基配制要求，进行培养基配制、分装与高压灭菌。

1.4.2藻种复苏

取10 mL所购买藻种，加入10 mL BG11培养液，置于人工气候培养箱中培养。每日镜下观察培养液中藻类形态，待藻类状态正常时进行扩增培养。

1.4.3藻种传代

用移液枪取1 mL藻类原培养液，置于100 mL新配制的BG11培养液中，混匀，放置于人工气候培养箱培养。

1.5 致嗅物质检测方法

1.5.1藻类培养液样品的准备

将藻类培养液混匀，取1 000 mL容量瓶，少量纯水打底，用移液枪取1 mL藻类原培养液至1000 mL容量瓶中，定容摇匀。取顶空瓶，用10.00 mL移液管从已定容的容量瓶中量取10.00 mL稀释培养液至顶空瓶中，加入3 g氯化钠，加入内标物(2-异丁基-3-甲氧基吡嗪，浓度40 ng/L)，立即加盖密封，摇匀，待测。

1.5.2检测仪器参数

顶空固相微萃取进样条件：加热平衡温度，60℃；加热平衡时间，30 min。

气相色谱仪参考条件：进样口温度，250℃；进样方式，不分流进样；升温程序，起始温度60℃保持2.5 min，以8℃/min速率升至250℃，保持5 min；离子源温度，230℃；连接线温度，280℃；离子化能量，70 Ev；扫描模式，选择离子检测(SIM)，选择离子检测参数见表 3。

1.6 藻类计数方法

参考《内陆水域浮游植物监测技术规程》(SL 733—2016 )中密度分析要求[7]，在光学显微镜下计数。

2 结果与讨论

2.1 藻类培养条件的确定

结合目前湖泊、水库中蓝藻繁殖季节的温度和蓝藻的生活习性，确定了藻类培养温度为25℃，湿度为60%，光照为1 200 Lux。

每日对藻类培养液进行摇匀，以避免藻类过度聚集，影响生长。同时，应每日随机改变藻类培养液在人工气候培养中的位置，以保证藻类均匀接收到光照。

2.2 藻类传代方式的确定

尝试了两种传代方式，一种是对藻类培养液进行离心，分离出藻类，再对藻类进行复溶，随后稀释转接进入培养基进行传代。使用该方法传代后，在显微镜下观察藻类形态，发现藻类损伤严重，需要1周甚至更长的时间才能恢复到正常状态。

另一种是选择用移液枪取适量原藻类培养液，转移进入新配培养基，进行稀释的传代方式。该方式下在藻类传代后隔日镜下观察发现其形态正常，在生长周期内状态较稳定。

因此，最终选择在1 ∶100(原培养液 ∶培养基)的条件下，用移液枪进行稀释传代，不再进行离心。传代周期为25～32 d。

2.3 致嗅物质检测方法的性能考察

在确定了藻类培养方式后，使用固相微萃取-气相色谱/质谱联用仪对藻类培养液中土臭素、2-甲基异莰醇进行检测。

2.3.1方法的标准曲线

使用内标法进行定量，绘制标准曲线，曲线范围在0～100 ng/L。以目标物质质量浓度为横坐标、定量离子峰面积为纵坐标，得到土臭素拟合曲线方程为：y=1.220 988x+0.008 057，R2=0.999 3；2-甲基异莰醇拟合曲线方程为：y=0.490 214x-0.003 701，R2=0.999 9。该方法浓度点设置均匀，线性良好。

2.3.2方法的检出限

根据检出限计算公式MDL=3.143S(n=7)，计算得到土臭素与2-甲基异莰醇的检出限见表4。

表4 致嗅物质的检出限

2.3.3方法的精密度与准确度

向水体中分别加入10与20 ng/L标准物质，进行回收率与精密度实验，土臭素与2-甲基异莰醇的加标回收率在95%～107%之间，相对标准偏差小于5%。该检测方法的回收率较高，精密度较好。

2.4 藻类计数方式的确定

使用阳性纯藻种(伪鱼腥藻)进行测定(n=12)，计数平均值为538×104cells/L，相对标准偏差为2.3%。该方法计数准确，精密度较好。

2.5 藻类产生致嗅物质情况

对培养的伪鱼腥藻、水华束丝藻和拉式拟浮丝藻，在传代初期、中期、末期分别进行嗅味物质检测，其检出结果见表5。

结果显示，在3种藻类传代后的初期、中期、末期，只有伪鱼腥藻可以检出2-甲基异莰醇，其余藻类均未检出致嗅物质，土臭素在3种藻类培养液中均未检出。伪鱼腥藻的藻类计数结果与2-甲基异莰醇的检出数据为正相关。

表5 3种培养藻类产生致嗅物质的情况

3 结论与展望

通过条件摸索，初步建立了伪鱼腥藻、水华束丝藻、拉式拟浮丝藻的培养与传代方式。结合培养情况，确定了藻类计数与土臭素、2-甲基异莰醇的检测方法。初步搭建了藻类计数与致嗅物质相关性研究平台。未来，应进一步采用所确定的方法开展藻类培养的相关研究。同时联系实际供水生产需要，找到水体中各类致嗅物质与相关藻类的关系，深入研究藻类对环境、水质的影响，从而更好地摸索出藻类致嗅物质的控制方法，提升供水水质。