不同激活比例和干预频率富血小板血浆对大白兔 半月板损伤修复的效果研究

仇建军 石文俊 邹翰林 张磊

既往临床认为半月板是无功能的残留物，但随着运动医学的不断发展，对半月板功能的认识越来越深入，半月板的功能也被熟知[1]。半月板损伤是临床上常见的关节损伤类型，近年越来越多的学者发现富血小板血浆(PRP)在半月板损伤修复中起到重要作用，但对于PRP的激活方式及比例、应用方式、应用频率均无统一标准[2]。本研究以大白兔为研究对象，分为Ⅰ期和Ⅱ期试验，分析PRP不同激活比例和干预频率对半月板修复的影响，进一步为临床应用PRP治疗半月板损伤提供理论依据，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2021年4月至2021年6月期间上海中医药大学附属普陀医院实验室培养的成年健康大白兔68只作为研究对象，其中雄性大白兔35只，雌性大白兔33只，年龄1～2岁，平均年龄（1.4± 0.2）岁，体质量为2.3～3.3 kg，平均体质量（2.8± 0.3） kg。所有大白兔双膝均建立半月板损伤模型，以关节腔内注射PRP凝胶的右膝关节为试验组，以关节腔内注射不含PRP凝胶的左膝关节为对照组，进行Ⅰ期试验和Ⅱ期试验。

1.2 方法

1.2.1 半月板损伤建模

所有大白兔双膝进行半月板损伤建模，麻醉后内侧入路切开内侧副韧带做一长2 cm弧形的切口，沿髌骨内侧上缘至胫骨结节，切开所有皮肤和皮下组织。半月板拉钩显露出内侧半月板前角、体部和股骨踝软骨面。采用刀片在内侧半月板游离缘做一长0.6 cm的纵行全层裂伤，术后缝合关节囊，肌注60万单位青霉素以预防术后感染。

1.2.2 PRP凝胶制备

采集兔血标本置入离心管旋转离心，离心力200 g，离心时间10 min。离心结束后兔血呈上、下2层，上层为血清，下层为血浆，血清与血浆交界处有一薄层，即为富血小板。保留上层血清，交换血清下层1～2 mm处的红细胞，去除含红细胞的底层液体。以200 g的离心力对血清液体进行旋转离心10 min，使血小板聚集在离心管底部。去除离心管内大部分上层血清，约占血清总量的3/4。将剩余的血清液体摇匀，得到PRP。在PRP中加入激活剂，等待6～10 s，可形成PRP凝胶。

1.2.3 干预方法

Ⅰ期试验：将36只大白兔右膝关节按随机数字表法分为A、B、C 3组，每组各12膝，以大白兔左膝关节为对照组。A、B、C组大白兔右膝关节腔内分别注射激活比例为3∶1、5∶1、7∶1的自体PRP凝胶，对照组大白兔左膝关节腔注射不含PRP的凝胶，每周注射1次，且均在注射后使用夹板固定膝关节2周。

Ⅱ期试验：将32只大白兔右膝关节按随机数字表法分为A、B、C、D 4组，每组各8膝，以大白兔相应左膝关节为对照1、2、3、4组。A组仅进行1次右膝关节腔内PRP凝胶注射治疗，对照1组左膝关节腔注射1次不含PRP的凝胶；B组每周进行1次右膝关节腔内PRP凝胶注射治疗，对照2组左膝关节腔每周注射1次不含PRP的凝胶；C组每2周进行1次右膝关节腔PRP凝胶注射治疗，对照3组左膝关节腔每2周注射1次不含PRP的凝胶；D组每4周进行1次右膝关节腔PRP凝胶注射治疗，对照4组左膝关节腔每4周注射1次不含的PRP凝胶。所有大白兔注射的PRP激活比例均为7∶1，且在所有治疗结束后进行夹板固定膝关节2周。

1.2.4 大白兔处理方法

Ⅰ期试验：PRP凝胶治疗后4、8、12周，每组分别以空气栓塞的方式处死4只大白兔，取大白兔半月板，对半月板标本采用10%甲醛固定液固定、洗涤、脱钙、透明、透蜡、包埋等，制备成石蜡切片，苏木精-伊红染色（HE染色），在光学显微镜下观察半月板的结构情况。

Ⅱ期试验：于PRP凝胶治疗后第8周和第12周，每组分别处死4只大白兔，以空气栓塞的方式处死大白兔，取大白兔半月板，将半月板标本采用10%甲醛固定液固定、洗涤、脱钙、透明、透蜡、包埋等，制备成石蜡切片，HE染色，在光学显微镜下观察半月板的结构情况。

1.3 观察指标

根据石蜡切片观察Ⅰ、Ⅱ期试验不同时期大白兔半月板损伤愈合情况。愈合等级评估标准[3]：Ⅰ级为损伤区创缘整齐，无纤维组织增生，无幼稚成纤维细胞；Ⅱ级为损伤区创缘新生胶原纤维，创缘可见软骨细胞密度增大；Ⅲ级为损伤区创缘内有胶原纤维填充，但填充区域无纤维软骨细胞或未形成软骨陷窝；Ⅳ级为损伤区创缘内存在大量胶原纤维填充，有少量纤维软骨细胞或形成软骨陷窝；Ⅴ级为切片无法辨认创缘，纤维软骨分布均匀。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件，计数资料用百分比表示，采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Ⅰ期试验

2.1.1 4周时半月板愈合等级比较

Ⅰ期试验4周时，A、B、C组半月板愈合等级差异无统计学意义（P＞0.05），3组与对照组半月板愈合等级差异均无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

表1 Ⅰ期试验4周时半月板愈合等级比较/侧

2.1.2 8周时半月板愈合等级比较

Ⅰ期试验8周时，A、B、C组半月板愈合等级差异无统计学意义（P＞0.05），A、B组与对照组半月板愈合等级差异无统计学意义（P＞0.05），C组与对照组半月板愈合等级差异有统计学意义 （P＜0.05）（表2）。

表2 Ⅰ期试验8周时半月板愈合等级比较/侧

2.1.3 12周时半月板愈合等级比较

Ⅰ期试验12周时，C组半月板愈合等级优于A组、B组和对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；A组、B组与对照组半月板愈合等级差异无统计学意义（P＞0.05）（表3）。

表3 Ⅰ期试验12周时半月板愈合等级比较/侧

A组HE染色显示右侧损伤区内部有胶原纤维组织填充，相互编织连接，但未发现纤维软骨细胞，无软骨凹陷形成（下页图1a）。B组HE染色显示右侧损伤区内部有胶原纤维组织填充，相互编织连接，有软骨陷窝形成（下页图1b）。C组HE染色显示右侧损伤区内部有大量胶原纤维组织填充，相互编织连接，还有少数纤维软骨细胞和软骨陷窝形成（下页图1c）。对照组HE染色显示右侧损伤区创面边缘整齐，无明显纤维组织增生，无幼稚成纤维细胞生成（下页图1d～f）。

图1 Ⅰ期试验12周时，HE染色（×100） a. A组 b. B组 c. C组 d～f. 对照组

2.2 Ⅱ期试验

2.2.1 8周时半月板愈合等级比较

Ⅱ期试验8周时，A、B、C、D组半月板愈合等级差异无统计学意义（P＞0.05）；A、B、C、D组半月板愈合等级均优于对照1、2、3、4组，差异有统计学意义（P＜0.05）（下页表4）。

表4 Ⅱ期试验8周时半月板愈合等级比较/侧

2.2.2 12周时半月板愈合等级比较

Ⅱ期试验12周时，A、B、C、D 4组半月板愈合等级差异无统计学意义（P＞0.05）；4组半月板愈合等级均优于对照1、2、3、4组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表5）。

表5 Ⅱ期试验12周时半月板愈合等级比较/侧

A、B、C、D组HE染色显示右侧损伤区内部有胶原组织填充，相互编织连接，偶有发现软骨陷窝形成（图2a～d）。对照1、2、3、4组HE染色显示左侧损伤区局部无明显纤维组织增生，未发现幼稚成纤维细胞（图2e～h）。

图2 Ⅱ期试验12周时，HE染色（×100） a. A组 b. B组 c. C组 d. D组 e. 对照1组 f. 对照2组 g. 对照3组 h. 对照4组

3 讨论

PRP来源广泛，制备简单，且安全性较高，被临床广泛应用于组织修复，在肌肉、肌腱、韧带、创面、骨损伤中均具有良好的应用前景[4-5]。李朝晖等[6]研究发现，PRP具有损伤小、疗程短、不易复发、安全性高等优势。史昱晖等[7]研究发现，PRP在缓解膝关节疼痛、改善膝关节功能方面具有较好效果，能明显提高关节功能，改善患者生活质量。因此，多数学者认为PRP在修复关节损伤中也有良好效果[8-10]。

半月板是胫骨关节面上内侧和外侧半月形状骨，其血供局限于外侧1/3，来源于半月板前后角韧带滑膜套。半月板内侧1/3无毛细血管，因此内侧1/3又称为无血运区，由于缺少血供，损伤后难以修复[11-13]。近年来越来越多的学者进行大量体外研究，发现采用PRP治疗半月板损伤具有较好的修复作用[14-16]。但体内实验的结果却不尽人意。临床上对于PRP的激活方式、激活比例、应用方式、应用频率等均无统一标准，因此探究PRP的激活比例、应用频率等，有助于为临床应用PRP治疗半月板损伤提供统一标准。本研究对我院培养的大白兔双膝进行半月板损伤建模，应用不同激活比例和不同干预频率分别进行Ⅰ期和Ⅱ期试验。Ⅰ期试验结果显示，在治疗4周后，3∶1、 5∶1以及7∶1的PRP激活比例治疗半月板损伤效果并无明显差异，A、B、C组与对照组治疗效果也无明显差异；治疗后8周和12周时，C组半月板愈合等级明显优于A组、B组和对照组。究其原因，前4周治疗效果不明显可能是由于治疗时间尚短，效果并不突出；治疗后8周和12周，7∶1 激活比例的PRP对半月板损伤的修复效果较佳，明显优于3∶1和5∶1激活比例的PRP，提示7∶1 激活比例的PRP修复半月板损伤效果较好。Ⅱ期试验结果显示，无论治疗8周还是12周，A、B、C、D组半月板愈合等级均无差异，且4组均优于对照1、2、3、4组，结果提示不同干预频率的PRP注射并不会影响PRP对半月板损伤的愈合效果，且对半月板损伤均具有较好修复效果。这可能是由于血小板源性生长因子体内代谢及关节活动影响了组织修复[17]。

综上所述，半月板损伤修复主要取决于PRP凝胶制备时的激活比例，7∶1的PRP凝胶对半月板损伤修复效果最佳。而PRP凝胶注射频率对半月板的影响，仍然需要进一步深入研究。