姜黄素对乳腺癌细胞增殖、侵袭的影响及相关机制研究

严其高,金 耀,刘金林,刘 毅,祁冰洁

(安庆医药高等专科学校教务处,安徽 安庆 246052)

乳腺癌是临床常见的恶性肿瘤，占所有妇女癌症的16%，伴随城市化进程、人口老龄化进程的加速，以及经济水平的提高和生活方式的改变，乳腺癌的发病率有逐年升高的趋势[1]。一项流行病学研究表明，我国乳腺癌的发病率为41.64/10万[2]。近年来，乳腺癌在流行病学、遗传学、分子生物学方面的研究均成为医学工作者研究的热点。生活方式、环境因素、慢性感染等都是乳腺癌发生的重要影响因素，而以上因素都可以直接或间接通过改变参与多种细胞途径的基本表达蛋白，影响肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡过程[3-4]。姜黄素，是从姜黄属植物姜黄、郁金、莪术等植物中提取的一种天然多酚类化合物[5]。传统中医学认为，姜黄素具有扶正祛邪、破血行气、活血化瘀等功效，常将其应用于临床炎症的预防以及相关慢性疾病的治疗中[6]。关于姜黄素与肿瘤机制的研究是临床上的另一个热点，大量的研究表明，姜黄素对肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移具有显著的抑制作用[7-8]。具体的作用机制涉及到诱导肿瘤细胞周期停滞、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管生长、抑制肿瘤侵袭和转移等[9]。本文探讨了姜黄素对乳腺癌细胞生物学行为的影响及相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料人乳腺癌MCF-7细胞株由中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心提供。主要试剂：MTT试剂盒购于美国eBscience公司；RT-PCR检测试剂盒购于上海生工有限公司；Transwell小室购自美国Chemicon；Lipofectamine2000 与 Trizol 试剂购自美国 Invitrogen；姜黄素购于美国Sigma公司。

1.2 细胞的培养及分组人乳腺癌MCF-7细胞株加入10%胎牛血清培养基，调整细胞浓度为5×105个/mL，接种于培养皿(37 ℃、5%CO2)，24 h更换一次培养基。待细胞融合度达到80%～90%时进行细胞传代，经0.25%胰蛋白酶消化为单细胞悬液后终止消化。置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养，当细胞生长贴壁后分为：空白对照组、姜黄素干预A组、姜黄素干预B组、姜黄素干预C组、姜黄素干预D组。空白对照组经生理盐水处理，其余各组分别加入姜黄素进行干预，浓度分别为10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L。

1.3 MTT实验检测细胞增殖情况将细胞密度调整为3×104/mL，接种于96孔培养板，应用无酚红培养基重悬细胞。24 h后，空白对照组、姜黄素干预A组、姜黄素干预B组、姜黄素干预C组、姜黄素干预D组分别加入20 μL的生理盐水、10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L的姜黄素，每组设6个复孔。于37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养，分别于12 h、24 h、36 h、48 h时加入5 mg/mL噻唑蓝(MTT)20 μL，37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养4 h，加入二甲基亚砜反应10 min，492 nm波长测定各组吸光度值(OD)，计算细胞增殖率。细胞增殖率=(OD姜黄素干预组/OD空白对照组)×100%。

1.4 Transwell小室法检测细胞侵袭情况应用无血清培养基稀释Matrigel基质胶，均匀铺在Transwell上室(每小室60 μL)，于37 ℃培养1 h，待胶凝固后，吸出残余液体，加入培养基水化基底膜(70 μL)。将各组细胞经生理盐水或姜黄素干预后，进行常规消化后，调整细胞密度为1×105/mL，取200 μL细胞悬液接种于Transwell上室。下室中加入DMEM培养基(含10%胎牛血清)。小室置于37 ℃培养箱中，48 h后，经4%多聚甲醛固定，20 min后，经结晶紫溶液染色(5%，5 min)。冲洗后，倒置显微镜拍照，对透膜细胞进行计数。实验重复3次。

1.5 RT-PCR法检测JAK2/ STAT3信号通路相关因子表达各组细胞经生理盐水或姜黄素干预12 h后，以β-actin作为内参基因，采用RT-PCR法检测各组细胞中的JAK2/ STAT3信号通路相关因子p-STAT3、p-JAK2、MMP-9、MMP-2的mRNA水平。实验重复3次。

按照Trizol试剂盒中说明书的步骤提取总RNA，参照说明书逆转录后进行PCR反应，引物序列见表1。PCR反应条件：变性(95 ℃，10 s)→退火(60 ℃，30 s)→延伸(70 ℃，5 min)，共计40个循环。引物的设计与合成来自生工生物工程(上海)股份有限公司，各引物序列见表1。2-△△Ct法计算各指标mRNA的相对表达量。

表1 RT-PCR引物序列

1.6 统计学分析应用SPSS 25.0进行统计学分析，计量资料用“均数±标准差”表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。假设检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 不同浓度姜黄素对乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制作用各时间点，姜黄素干预组MCF-7细胞增殖率均明显低于空白对照组同期(P<0.05)。伴随时间的进展，各组黄素干预组的细胞增殖率明显降低(P<0.05)，具有时间依赖性。各时间点，姜黄素浓度越高，MCF-7细胞增殖率越低(P<0.05)，具有剂量依赖性。见表2。

表2 各组乳腺癌MCF-7细胞增殖率比较

2.2 不同浓度姜黄素对乳腺癌MCF-7细胞的侵袭抑制作用各时间点，姜黄素干预组MCF-7细胞透膜数量均明显少于空白对照组同期(P<0.05)。各时间点，姜黄素浓度越高，MCF-7细胞透膜数量越少(P<0.05)，具有剂量依赖性。见表3。

表3 各组乳腺癌MCF-7细胞透膜细胞数量比较

2.3 不同浓度姜黄素对乳腺癌MCF-7细胞中JAK2/ STAT3信号通路相关因子表达的影响姜黄素干预组各组MCF-7细胞中p-STAT3、p-JAK2、MMP-9、MMP-2 mRNA表达水平均明显低于空白对照组(P<0.05)。姜黄素浓度越高，MCF-7细胞中p-STAT3、p-JAK2、MMP-9、MMP-2 mRNA表达水平越低(P<0.05)，具有剂量依赖性。见表4。

表4 各组乳腺癌MCF-7细胞中p-STAT3、p-JAK2、MMP-9、MMP-2mRNA表达水平比较

3 讨论

迄今为止，现代医学治疗乳腺癌的主要方法包括放疗、化疗、内分泌治疗、手术治疗等，但存在生存率不理想，不良反应发生率高等情况，探索疗效理想、安全性高的乳腺癌综合疗法是该领域学者们研究的热点。中医学将乳腺癌归为“乳岩”、“乳痈”、“乳疳”等范畴，擅长从整体出发探索本病的病因病机，主张通过调整气血及阴阳平衡，扶正祛邪、辨证施治。迄今为止，疏肝解郁、养血柔肝、解毒散结、养阴生津等都是中医药领域治疗乳腺癌的传统思路[10]。姜黄素在慢性疾病、肿瘤疾病等治疗中发挥的扶正祛邪、破血行气、活血化瘀等功效，已经得到证实，具体的作用机制涉及抑制肿瘤增殖、调节能量代谢、抑制血管生成、诱导肿瘤细胞凋亡、调节机体免疫、逆转细胞多药耐药性、诱导细胞自噬等方面[6]。本研究将姜黄素干预组根据不同的作用浓度进行亚组的分组，研究结果显示，姜黄素对乳腺癌MCF-7细胞的增殖具有明显的抑制作用，且这种作用具有时间依赖性和剂量依赖性。Transwell小室实验结果也显示，姜黄素干预组MCF-7细胞透膜数量均明显少于空白对照组同期，且姜黄素的药物浓度越高，MCF-7细胞透膜数量越少。充分证实了姜黄素的抑瘤效应。

目前，诱发乳腺癌的风险因素相关作用机制逐渐清晰，相关信号转导通路与肿瘤的发生发展之间的关系研究，也逐步开展[11]。信号转导和转录激活因子3(STAT3)是STAT家族成员之一，其在细胞的生物学行为调控中发挥重要作用，在多种致瘤因素的刺激下，STAT3可被激活，通过调控靶基因转录，实现相关作用机制[12]。Janus激酶2(JAK2)是一种非受体酪氨酸激酶，位于STAT3的上游，能够促进Tyr-750位点上STAT3的磷酸化[13]。磷酸化的STAT3(p-STAT3)能够参与肿瘤相关信号的传导，增强肿瘤细胞活性。目前，关于JAK2/STAT3信号通路与乳腺癌之间的关系研究已相对成熟，得到证实的是，STAT3在乳腺癌的发生中具有显著的致癌潜力，与本病的发生、进展、侵袭、转移、血管生成、耐药性等均密切相关[14]。基质金属蛋白酶(MMPs)是肿瘤侵袭转移相关过程中的重要因素，MMP-9、MMP-2是经证实的位于STAT3下游的重要靶基因，近年来的研究发现，MMP-9、MMP-2表达与STAT3的活性密切相关，STAT3激活后可通过上调MMP-9、MMP-2的表达，促进肿瘤细胞的侵袭与转移[15-16]。本研究发现，姜黄素干预组各组MCF-7细胞中p-STAT3、p-JAK2、MMP-9、MMP-2 mRNA表达水平均明显低于空白对照组，且这种干预效果具有一定的剂量依赖性。说明姜黄素对JAK2/STAT3信号通路的激活具有显著的抑制作用。

综上所述，本研究表明姜黄素对乳腺癌具有显著的抑瘤效应，能够抑制肿瘤细胞增殖和侵袭，这与其对JAK2/STAT3信号通路的显著抑制效应有关。然而，JAK2/STAT3信号通路的下游分子和作用靶点众多，在后续的研究中，我们将进一步分析姜黄素调控乳腺癌细胞生物学行为的其他机制，为乳腺癌的发生发展机制研究提供参考。