树豆叶醇提物通过mTOR/S6K1降低T1DM小鼠胰岛素抵抗

余晓艳，谯 艳，黄 婧， 刘 云

绵阳市中心医院内分泌科，绵阳 621000

糖尿病是由遗传因素、免疫功能紊乱等多种因素导致机体胰岛功能减退、胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)等进而引发糖、蛋白质、脂肪等代谢紊乱的综合征[1-2]。中药材是纯天然产物，具有毒副作用小、不产生耐药性等优点，备受研究者青睐。树豆是蝶形花科木豆属的多年生灌木，研究显示其脂溶性部位有降血糖、血脂作用[3-4]。叶贵梅等[5]研究显示，树豆叶醇提物可一定程度改善糖尿病大鼠糖代谢和脂代谢。既往研究显示，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/核糖体S6激酶1(mammalian target of ra-pamycin/S6kinse1，mTOR/S6K1)通路活化与糖尿病IR的发生、发展关系密切[6]。目前有关树豆叶醇提物对糖尿病的调控作用是否与抑制mTOR/S6K1通路活化有关少见报道，因此本研究探讨树豆叶醇提物对1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)小鼠IR作用的影响，并分析可能的机制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

ACCU-CHEK Advantage Ⅱ型血糖仪，北京中西远大科技有限公司；BK-400型全自动生化分析仪，山东博科生物科技有限公司；HBS-ScanX全波长酶标仪，南京德铁实验设备有限公司；

1.2 试药

脲佐菌霉素(streptozotocin，STZ)购自上海信帆生物科技有限公司；兔抗鼠mTOR、p-mTOR、S6K1、p-S6K1、β-actin抗体及山羊抗兔HRP二抗，均购自北京索莱宝科技有限公司；胰岛素放免试剂盒购自昀冠(上海)生物科技有限公司；Trizol试剂及BCA蛋白定量分析试剂盒均购自美国Thermo Fisher；逆转录试剂盒购自日本Takara；上样缓冲液购自北京Solarbio；PIRA裂解液购自康迪斯化工(湖北)有限公司。

1.3 动物

60只SPF级、6周龄SD雄性小鼠，体质量20～30 g，平均体质量(25±5) g，购自北京唯尚立德生物科技有限公司，许可证为[SCXK(京)2016-0009]。

2 方法

2.1 树豆叶醇提物制备

取干燥树豆枝叶100 g，置于1 000 mL圆底烧瓶中，加体积分数为95%的乙醇600 mL回流提取3次，每次2 h，合并提取液，减压回收干燥，将浸膏分散于1 000 mL热水中，超声处理使其成为均匀的混悬液并冷却至室温后置于4 ℃冰箱过夜，离心，弃去上清液，沉淀用热水同法洗涤3次后再混悬于水中，先用石油醚50 mL萃取3次以除去叶绿素，再用50 mL氯仿萃取3次，减压回收氯仿，得到树豆脂溶性部位5 g，用质量浓度为5 g·L-1的羧甲基纤维素钠(CMCNa)研磨，备用。

2.2 T1DM模型建立

将小鼠适应性喂养3 d后，禁食不禁水12 h后以多次小剂量法注射30 mg·kg-1STZ(每日1次，连续5 d)建立T1DM模型，注射结束7 d后，小鼠禁食不禁水10 h，采集尾静脉血测空腹血糖，以空腹血糖>11.1 mmol·L-1视为造模成功。

2.3 分组及处理

将60只大鼠随机分为对照组(以普通饲料饲养)、模型组及树豆叶醇提物低、中和高剂量组，每组10只。树豆叶醇提物低、中和高剂量组于模型建立成功后，同时间分别给予树豆叶醇提物50、100、150 mg·kg-1·d-1[5]灌胃处理；对照组、模型组于同时间给予等量CMCNa灌胃处理，每日1次，连续4周，期间均用普通饲料饲养，并观察小鼠一般情况。

2.4 标本采集

给药4周结束后，在大鼠空腹12 h情况下用40 mg·kg-1戊巴比妥钠麻醉大鼠，眼眶静脉丛取血，及时测定并记录空腹血糖，静置1 h后，以3 000 r·min-1离心10 min，取上清液于-80 ℃冰箱保存待测；随后将大鼠颈椎脱臼处死，取胰腺组织并分为两部分，保存于液氮中用于后续实验。

2.5 胰岛素抵抗相关指标检测

用BK-400型全自动生化分析仪测定空腹血糖(asting plasma glucose，FPG)水平；用HBS-ScanX型酶标仪测定血清胰岛素(insulin，INS)水平；用胰岛β细胞功能指数(homeostasis model assessment for insulin secretion index，HOMA-β)评估β细胞功能；用稳态评估模型评估胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)；用定量胰岛素敏感性检测指数(quantitative insulin check index，QUICKI)评价胰岛素敏感度。

2.6 实时荧光定量PCR法

取2.4各组其中一份胰腺组织，Trizol法提取总RNA并测质量浓度，以RNA为模板进行逆转录反应得cDNA，以其为模板链进行实时荧光定量PCR反应。按照试剂盒说明书设置反应体系；反应条件为预变性95 ℃ 30 s，变性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 20 s，重复40个循环。扩增值阈值所需循环次数(CT值)，mTOR、S6K1均以β-actin作为内参，以2-△△CT法计算mTOR、S6K1 mRNA相对表达量。引物由大连宝生生物工程有限公司设计并合成，引物序列分别为：正向引物5′-3′：AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC，反向引物5′-3′：GGGGTCATTGATGGCAACAATA；正向引物5′-3′：TGGAGTTGGGGGTTTCTGTA，反向引物5′-3′：TTCAGTGCACAGGTTCAAGC；正向引物5′-3′：GTCAACGGATTTGGTCTGTATT，反向引物5′-3′：AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT。

2.7 免疫印迹法

取2.4各组大鼠胰腺组织，剪碎制备匀浆，以RIPA液冰上裂解，孵育20 min，以10 000 r·min-1离心10 min(离心半径为8 cm)取上清，测定蛋白总量并取20 μg与等量上样缓冲液混匀，沸水浴变性，进行电泳、转膜，以质量浓度为0.5 g·L-1的脱脂奶粉封闭2 h，TBST清洗，之后加入mTOR、p-mTOR、S6K1、p-S6K1及内参β-actin作为一抗(1∶500)，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤，加入山羊抗兔二抗(1∶1 000)，37 ℃ 1.5 h，显影、定影，计算目的基因蛋白相对表达量。

2.8 统计学方法

3 结果

3.1 一般情况比较

除对照组外，其余各组大鼠皮毛松散、毛色发黄，无光泽，精神萎靡，嗜睡，时常扎堆，活动减弱，反应迟钝，多饮、多食、多尿，尿色偏黄，与对照组比较体质量增加较快。树豆叶醇提物低、中、高剂量组大鼠一般状况优于模型组，其中高剂量组改善最为明显。

3.2 各组大鼠胰岛素相关指标比较

与对照组比较，模型组大鼠FPG、INS、HOMA-IR水平升高，HOMA-β、QUICKI水平降低(P<0.05)；与模型组比较，树豆叶醇提物低、中、高剂量组大鼠FPG、INS、HOMA-IR水平降低，HOMA-β、QUICKI水平升高(P<0.05)，呈剂量依赖性。见表1。

表1 各组大鼠胰岛素相关指标比较

3.3 各组大鼠胰腺组织中mTOR、S6K1 mRNA表达

与对照组比较，模型组大鼠胰腺组织中mTOR、S6K1 mRNA水平均升高(P<0.05)；与模型组比较，树豆叶醇提物低、中、高剂量组大鼠胰腺组织中mTOR、S6K1 mRNA水平均降低(P<0.05)，呈剂量依赖性。见表2。

表2 各组大鼠胰腺组织中mTOR、S6K1 mRNA表达

3.4 大鼠胰腺组织中mTOR/S6K1通路蛋白表达

与对照组比较，模型组大鼠胰腺组织中p-mTOR/mTOR、p-S6K1/S6K1水平均升高(P<0.05)；与模型组比较，树豆叶醇提物低、中、高剂量组大鼠胰腺组织中p-mTOR/mTOR、p-S6K1/S6K1水平均降低(P<0.05)，呈剂量依赖性。见图1及表3。

注：A.对照组；B.模型组；C.树豆叶醇提物低剂量组；D.树豆叶醇提物中剂量组；E.树豆叶醇提物高剂量组。

表3 各组大鼠胰腺组织中mTOR/S6K1通路蛋白表达比较

4 讨论

T1DM又称为胰岛素依赖型糖尿病，属于自身免疫性疾病，是由于机体选择性攻击胰腺细胞，造成D细胞大量破坏、胰岛β细胞发生自身免疫破坏，胰岛素分泌严重不足，表现为高血糖和酮症酸中毒，并会引起严重代谢紊乱、感染性疾病、慢性并发症如微血管病变等问题，严重影响患者健康[7-10]。IR是指胰岛素作用的靶器官对胰岛素作用的敏感性下降，即正常剂量的胰岛素产生低于正常生物学效应的一种状态。研究显示，T1DM患者存在IR[11]。

树豆是蝶形花科木豆属多年生常绿灌木，研究显示，其脂溶性部位能够降血糖、调节血脂[13]。叶贵梅等[5]研究显示，树豆叶醇提物对糖尿病大鼠糖代谢和脂代谢具有一定调节作用。本研究结果显示，除对照组外，其余各组大鼠皮毛松散、毛色发黄，无光泽，精神萎靡，嗜睡，时常扎堆，活动减弱，反应迟钝，多饮、多食、多尿，尿色偏黄，与对照组比较，体质量增加。树豆叶醇提物低、中、高剂量组大鼠一般状况优于模型组，随着用药时间的延长，大鼠一般状况明显得到改善，呈剂量依赖性。与叶贵梅等研究结果相似，说明树豆叶醇提物对T1DM有一定治疗作用。INS是一种蛋白质类激素，体内胰岛素是由胰岛β细胞分泌的，INS是机体内唯一降低血糖的激素，也是唯一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素[14]。HOMA-β反映胰岛β细胞合成并分泌胰岛素的能力，其值越高表明胰岛β细胞分泌胰岛素的能力越强[15]。HOMA-IR是用于评价个体胰岛素抵抗水平的指标，反映机体对胰岛素的敏感性[16]。QUICKI是描述胰岛素抵抗的程度，胰岛素敏感性越低，单位胰岛素的效果越差，分解糖类的程度越低，在分泌量足够的情况下，提高胰岛素敏感性是很好的治疗糖尿病的方法[17]。本研究结果显示，与对照组比较，模型组大鼠FPG、INS、HOMA-IR水平升高，HOMA-β、QUICKI水平降低；与模型组比较，树豆叶醇提物不同剂量组大鼠FPG、INS、HOMA-IR水平降低，HOMA-β、QUICKI水平升高，呈剂量依赖性。说明树豆叶醇提物能够降低T1DM小鼠血糖水平，降低IR，增加胰岛素敏感性。

研究显示，mTOR/S6K1通路与糖尿病IR发生、发展有关，当机体长期处于高质量浓度葡萄糖或氨基酸刺激，促使mTOR发生磷酸化反应，进而激活下游S6K1并使其发生磷酸化反应，阻止胰岛素信号传导最终产生IR[18-20]。本研究结果显示，与对照组比较，模型组大鼠胰腺组织中mTOR、S6K1 mRNA及蛋白水平均升高；与模型组比较，树豆叶醇提物低、中、高剂量组大鼠胰腺组织中mTOR、S6K1 mRNA及蛋白水平均降低，呈剂量依赖性。说明树豆叶醇提物能够降低T1DM小鼠血糖水平，降低IR，增加胰岛素敏感性，可能是通过抑制mTOR/S6K1通路活化实现的。

综上所述，树豆叶醇提物可能通过抑制mTOR/S6K1通路活化，降低T1DM小鼠血糖水平，降低IR以增加胰岛素敏感性。本研究并未能明确树豆叶醇提物对mTOR/S6K1通路的具体调控作用，后期应进一步深入阐述。