蜡样芽孢杆菌的检测分析

韩珍珍

（运城市综合检验检测中心，山西运城 044000）

由微生物引起的一系列食源性疾病是世界范围内日益严重的公共卫生问题之一[1]。我国每年由微生物导致的食物中毒占全部食源性疾病的50%左右[2-4]。其中，由蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）引发的食物中毒问题越来越受到人们的关注。该菌为兼性厌氧的杆状革兰氏阳性菌，为芽孢杆菌科蜡样芽孢杆菌属，广泛存在于空气、水体、土壤等环境中，为植物和动物的主要污染源，因此无法避免地会污染到食品[5]。少量蜡样芽孢杆菌不会引起食物中毒，但当被蜡样芽孢杆菌污染的食物加热不彻底，其会在食物中呈指数生长产生肠毒素，危害人体健康[6]。一般认为蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒属毒素型食物中毒。据国内外报道，几乎所有种类的食品中都有检测到蜡样芽孢杆菌[7-8]。本文对385份预包装类食品进行了蜡样芽孢杆菌的检测分析，期望为预防食品安全风险隐患，保障人们的饮食安全提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 样品

共采集8类预包装食品385份，分别为手抓饼、汉堡饼胚、速冻馅饼、糕点、饼干、速冻饺子、薯类和膨化食品和淀粉及淀粉制品，分别从各县市超市、零售店、批发市场及农贸市场以及网店购买。

1.2 菌株与试剂

阳性菌株：蜡样芽孢杆菌（ATCC11778）；阴性菌株：苏云金芽孢杆菌（ATCC10792）、蕈状芽孢杆菌（CICC21473）、巨大芽孢杆菌（ATCC14581）、大肠埃希氏菌[CMCC（B）44102]；甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）琼脂（200706）；动力培养基（200528）；硫酸锰营养琼脂培养基（201204）；胰酪胨大豆羊血（TSSB）琼脂（200330）；溶菌酶营养肉汤（2090819）；生化鉴定试剂盒（200518）；革兰氏染色液（陆桥，批号：200831）；BCL鉴定卡（梅里埃）。

1.3 仪器与试剂

BM-20AY落射荧光显微镜带照相系统（上海光学仪器）、浊度仪（法国生物梅里埃公司）、VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定及药敏分析系统（法国生物梅里埃公司）、BHC-1300Ⅱ生物安全柜（苏净集团）、生化培养箱（上海博迅）。

1.4 检测方法

本试验根据GB 4789.14-2014标准方法对385份样品进行蜡样芽孢杆菌检验。对检出蜡样芽孢杆菌的样品取n=5进行检验，依次编号为01～05共5组，每组做两个平行，步骤依次为增菌、分离、鉴定（生化鉴定和全自动生化鉴定仪）、计数。此次检测前对实验室的环境、关键培养基、菌种进行了验证，确保实验准确。

2 结果与分析

2.1 预包装食品中蜡样芽孢杆菌检出情况

通过对385份预包装食品进行蜡样芽孢杆菌的检测，只有速冻馅饼和速冻饺子中检出蜡样芽孢杆菌，总检出率为1.04%，合格率为98.96%。其中，速冻馅饼中蜡样芽孢杆菌检出率为5.17%；速冻饺子中蜡样芽孢杆菌检出率为1.27%，在几类食品中速冻馅饼检出率最高。具体结果见表1。

表1 各类预包装食品中蜡样芽孢杆菌检测结果

2.2 蜡样芽孢杆菌生化鉴定结果

2.2.1 革兰氏染色、动力、溶菌酶耐性、溶血、根状生长和毒素结晶试验结果

以培养出典型菌落的速冻馅饼样品为例，进行分析鉴定。挑取粉红色有沉淀环的可疑菌落（图1）划线接种于营养琼脂平板纯培养，进行确证实验。①革兰氏染色：单个菌落经革兰氏染色后，为阳性杆菌，芽孢呈椭圆形，位于菌体中央，多呈短链或长链状排列（图1）。②动力培养：培养基中可疑菌落沿穿刺线呈扩散生长，与蕈状芽孢杆菌“绒毛状”生长不同。③溶菌酶试验：在溶菌酶肉汤（含0.001%溶菌酶）中能生长，溶液浑浊。④溶血试验：在TSSB琼脂平板上可疑菌落呈浅灰色，不透明，似白色毛玻璃状，有溶血环（图2）。⑤根状生长试验：可疑菌落呈粗糙山谷状生长，蕈状芽孢杆菌呈根状生长。⑥蛋白质毒素结晶：可疑菌落与蜡样芽孢杆菌同样无蛋白质毒素结晶（图2）。

图1 MYP培养基上的菌落和放大1 000X的革兰阳性杆菌

图2 溶血试验、根状生长试验、蛋白质毒素结晶试验

2.2.2 生化鉴定

分别挑取纯培养的单个菌落，用生化鉴定试剂盒对可疑菌落进行生化鉴定，符合GB 4789.14—2014中蜡样芽孢杆菌的生化特征，同时用VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定系统鉴定可疑菌株与阳性蜡样芽孢杆菌相似，为97%。

2.2.3 菌落计算

由上述的一系列镜检及生化鉴定试验结果可得知，5份样品中有1份样品（编号为03）出现可疑菌落，共挑取6个菌落做生化鉴定，全部鉴定为蜡样芽孢杆菌。各稀释度蜡样芽孢杆菌典型菌落数计数结果如表2所示。编号03组的两个平行试验（03-1和03-2）只有10-3稀释度的各平板菌落数在20～200 CFU，编号03-1的菌落数为（36+40+45）×6/6×103=1.2×105CFU·g-1；03-2的菌落数为（30+39+41）×6/6×103=1.1×105CFU·g-1，03 组 的 平 均 菌 落 数 为1.1×105CFU·g-1。

表2 蜡样芽孢杆菌在MYP平板上的菌落计数

2.2.4 检验结果

根据MYP平板上的蜡样芽孢杆菌的典型菌落数，报告03菌落数为T=1.1×105CFU·g-1，依据蜡样芽孢杆菌食物中毒诊断标准及处理原则WS/T 82—1996判定该样品中蜡样芽孢杆菌为1.1×105CFU·g-1＞105CFU·g-1，由此可见编号03组速冻馅饼中的蜡样芽孢杆菌数超过限量，会引起食用者食物中毒。

3 结论与讨论

上述检测结果显示，385份预包装食品中速冻馅饼和速冻饺子中检出蜡样芽孢杆菌，检出率分别为5.17%、1.27%。由于馅饼及饺子的基质是面粉、牛肉、猪肉，肉类及米面食品是人体生命活动能量的主要来源，也非常适宜微生物的生长和繁殖，一旦处理不当就极易引起发食物中毒[9]。近些年，由食源性致病菌污染肉类食品和米面制品导致的食物中毒事件屡有发生，李光辉等[10]统计全国食物中毒特征分析，报道由微生物引起的食物中毒占比达38%～63%；江凯等[11]研究发现微生物因素引起的食物中毒占比达58%～72%；李可维等[12]对9 274份肉制品进行食源性致病菌检测，结果显示致病菌检出率最高为调理肉制品（混合类肉制品）。王霄晔等[13]、吴晓旻等[14]分析2018年全国食物中毒事件，由沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌等引起的细菌性食物中毒事件占总数的40%～69%，且多发生在学校、集体食堂和饮食服务单位。

蜡样芽孢杆菌广泛存在于自然界中，是一种常见的食源性条件致病菌，易引起呕吐和腹泻。本文速冻馅饼样品中蜡样芽孢杆菌检出值为1.1×105CFU·g-1，超过一般安全隐患限值。还有文献[15]提到食品中蜡样芽孢杆菌含量在103～105CFU·g-1，食品具有一般安全隐患，即使炒制加热等仍不能将杀灭该菌。有研究发现[16-18]在由蜡样芽孢杆菌引发的食物中毒中，部分案例含菌量较少（如＜102CFU·g-1）。因此，低菌量的蜡样芽孢杆菌污染也存在引发食源性疾病的风险，应引起重视。2018年，宋晓红等[19]抽检山西网络订餐194份，蜡样芽孢杆菌检出率最高，为13.9%，赵薇等[20]调查研究发现百货商场中蜡样芽孢杆菌检出率最高为32.4%，其次是小吃店及饮品店。这些场所所售食品具有快捷方便的特点，部分食品无需复热和加热可直接进食。2019年史一等[21]指出山西食源性疾病主要集中在5—10月，食源性疾病发病季节性明显，该季节湿热致病菌生长繁殖力强，人们会食用未高温享调过或加热不彻底的食品，若存在蜡样芽孢杆菌污染，大大增加了感染食源性疾病的风险。所以笔者建议居民短时间保存食物最好放置于冰箱中冷藏或冷冻，食用前微波加热，养成良好的生活习惯。

本文检测发现冷冻馅饼类食品检出率较高，主要原因分析如下。①食品原材料存在污染风险。②混合馅料加工过程污染，主要是绞肉、斩拌等加工环节较多，人员、设备、工具和环境卫生不达标，可能造成交叉污染。③运输过程污染，未保持全程冷链。因此，食品企业和监督部门应加大和完善对食品原材料、生产、加工环节、运输、储存以及销售等各个环节的卫生要求，加强对冷冻馅料食品中蜡样芽孢杆菌的检测监管，并纳入抽检规划。提高监测水平，增强消费者食品安全风险防范意识，加强生产加工从业人员的卫生意识培训，加强卫生监督及执法力度。