自拟补肾祛瘀方对多囊卵巢综合征模型大鼠的作用及机制研究*

牛永莉，王艳，孔丽，谢广妹

（1.酒泉市人民医院 生殖医学科，甘肃 酒泉 735000；2.甘肃省妇幼保健院 生殖中心，甘肃 兰州 730050）

多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome,PCOS）为育龄女性常见病，发病率约8%[1]。PCOS 是一种生殖功能障碍与糖代谢异常并存的内分泌紊乱综合征，目前认为与雄激素及促黄体生成素异常、胰岛素抵抗等多种因素有关[2]。PCOS 属中医“闭经”“不孕”范畴，以肾功能失调为本，痰浊、血淤为标，中医治疗宜补肾为主，祛瘀为辅[3]。以往研究表明[4]，中医治疗PCOS 费用低廉、不良反应少且无绝对用药禁忌，在PCOS 的临床治疗中受到重视。研究认为[5]，PCOS 的发生与肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）介导的核因子κB（nuclear factor κB, NF-κB）/核因子IκB（inhibitor of NF-κB,IκBα）信号通路激活有关。其中，NF-κB 有多项调控功能，调控TNF-α/NF-κB/IκBα 信号通路可成为PCOS 防治的新靶点，但目前相关的研究较少。本研究采用自拟补肾祛瘀方治疗PCOS 并分析其对TNF-α/NF-κB/IκBα 信号通路的影响，以期明确其治疗PCOS 的可能作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物80 只SPF 级SD 雌性大鼠，6 周龄，体重（180±10）g[由中国科学院上海药物研究所提供，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2020-0005]。喂养条件：温度20℃、湿度50%，每日喂新鲜水及饲料。

1.1.2 实验试剂和药物TNF-α 抗体、NF-κB（P65）抗体及IκBα 抗体（英国Abcam 公司），鼠抗人β-actin（生工生物工程上海股份有限公司），羊抗鼠二抗、DAB 显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），SYBP®Premix Ex TaqTM（日本TaKaRa 公司），PCR 引物（宝生物工程大连有限公司），TRIzol（美国英杰生命技术有限公司），TBST 试剂（上海科拉曼试剂有限公司）。补肾化瘀方（酒泉市人民医院中医药剂室配置），达英-35（拜耳医药保健有限公司），来曲唑（大连美仑生物技术有限公司），羧甲基纤维素钠、水合氯醛、0.9%氯化钠溶液（北京博尔迈生物技术有限公司）。

1.1.3 实验仪器台式高速离心机（美国Sigma 公司），电泳仪（美国BIO-RAD 公司），实时荧光定量PCR 仪、PCR 扩增仪、恒温箱（美国Thermo 公司），显微镜（日本奥林巴斯株式会社），酶标仪（美国Benchmark 公司），血糖仪（德国罗氏诊断有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型复制80 只大鼠随机分为对照组20 只、模型复制组60 只。采用来曲唑法复制模型：来曲唑灌胃1 mg/（kg·d），连续28 d，模型复制组给予高脂高糖饲料和9%葡萄糖水。模型复制成功后分为模型组、西药组及联合组，每组20 只。

1.2.2 药物干预对照组和模型组根据大鼠体重给予1 mL/（kg·d）氯化钠溶液灌胃，参考《中药药理研究方法学》[6]换算用药剂量。自拟补肾祛瘀方组成：女贞子、墨旱莲各15 g，菟丝子、山茱萸、丹参、川芎、赤芍、桃仁、红花各10 g，由医院中医药剂室加水煎煮成汤剂，汤剂终浓度为1 g/mL。联合组每天根据体重给予补肾祛瘀汤剂11 g/kg 和4.5 mg/kg 二甲双胍灌胃，西药组仅给予4.5 mg/kg 二甲双胍灌胃，联合组与西药组均灌胃28 d。

1.2.3 大鼠体重检测药物干预前及药物干预28 d 后称量各组大鼠体重，比较药物干预前后大鼠体重变化。

1.2.4 大鼠性激素水平检测大鼠于16 周龄、动情间期当晚20 点开始禁食，至次日早晨8 点空腹取腹主动脉血5～8 mL，3 500 r/min离心15 min，取上清液，置入-20℃冰箱冷冻保存待测。参照放射免疫法试剂盒说明书测定睾酮（T）、促卵泡激素（FSH）、黄体生成素（LH）的水平。抽血称重后采用脊椎脱臼法处死所有大鼠，取大鼠卵巢组织待测。

1.2.5 Western blotting检测大鼠卵巢组织中TNF-α、NF-κB、IκBα 蛋白相对表达量剪碎30 mg 卵巢组织，加1 mL PBS，10 000 r/min、4℃下离心1 min，洗净组织上的血污及黏液等。加300 μL 蛋白裂解液，研磨后置于冰上20 min 至细胞裂解。12 000 r/min、4℃下离心15 min，所得上清液即为全蛋白提取液，置于-80℃冷冻保存备用。提取蛋白液，电泳、转膜、封闭，取出PVDF 膜放入TBST 中漂洗3 次，分别加入TNF-α 抗体、NF-κB（P65）抗体、IκBα 抗体及鼠抗人β-actin，震荡过夜。取出膜，放入TBST 中漂洗3 次后置于二抗中震荡2 h。放入TBST 中漂洗3 次，滴加显色液，紧密结合膜蛋白面与胶片，强曝光5 min 左右，用Image Quant 350 成像系统扫描并保存图像，分析TNF-α、NF-κB、IκBα 蛋白相对表达量。

1.2.6 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测大鼠卵巢组织中TNF-α、NF-κB、IκBα mRNA 相对表达量洗净研钵等器皿，用双蒸水和焦碳酸二乙酯水分别冲洗，于180℃下烘烤4 h 去除RNA 酶。切取50～100 mg 组织在研钵中研磨成粉，将粉末移至无RNA 酶的EP 管中，加1 mL TRIzol 后混匀。静置5 min 后加入氯仿200 μL，震荡15 s 混匀，静置5 min，4℃下离心15 min。待EP 管中液体分层后，用100 μL 移液枪将上层液体吸到新的无RNA酶的EP 管中，并加入等体积异丙醇，混匀后静置10 min 并再次离心10 min。EP 管底部白色物质即为RNA，倒掉管中液体后加入1 mL 75%乙醇，颠倒EP 管数次，离心5 min。倒掉上清液，用移液枪吸净管底液体，静置5 min 干燥。加入30～50 μL DEPC 水并用移液枪吹打使RNA 充分溶解。取2 μL总RNA，凝胶电泳检测完整性。各组大鼠总RNA 的电泳图中可见明显2 个条带，根据迁移率分别是18 S 和28 S，且电泳图中无明显杂带和向前拖尾的现象，说明RNA 提取成功，完整性较高，纯度满足后续PCR 扩增要求。参照TaKaRa试剂盒说明书配制逆转录体系20 μL（5×PrimeScriptTMBuffer 4 μL、Total RNA 4 μL、RNase Free dH2O 12 μL），37℃15 min，85℃5 s，4℃30 min 获取cDNA。qRT-PCR 反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，95℃退火5 s、60℃延伸30 s，40 个循环，循环结束后95℃延伸15 s。引物序列：①TNF-α：正向5'-TCTCTTCAAGGGACAA GGCT-3'，反 向5'-TCCTGGTATGAAATGGCAAA-3'，引物长度78 bp；②NF-κB：正向5'-GCCTCATCCAC ATGAACTTG-3'，反向5'-CGCTTCTTCACACACTGG AT-3'，引物长度120 bp；③IκBα：正向5'-CTGTACG CCCCAGCATCT-3'，反向5'-GCACCCAAAGTCACCAA G-3'，引物长度144 bp；④β-actin：正向5'-CGGTCA GGTCATCACTATCG-3'，反向5'-TTCCATACCCAGGA AGGAAG-3'，引物长度79 bp。以β-actin 为内参，计算各组ΔΔCt，ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因，ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组。目的基因相对表达量用2-ΔΔCt表示。

1.2.7 免疫组织化学检测大鼠卵巢组织中TNF-α、NF-κB、IκBα 蛋白阳性表达卵巢组织常规固定、石蜡包埋、切片（厚度4 μm），脱蜡止水，5%的牛血清白蛋白封闭10 min。滴加一抗后4℃下过夜；滴加二抗后37℃下孵育20 min。苏木精复染2 min，脱水后常规透明、封片，显微镜下拍照，取5 个不同高倍镜视野，IPP 6.0 软件分析图像，记录阳性细胞平均光密度（OD）值，取3 次平均值作为最终结果，OD 值越高表示阳性表达率越高。阳性判定：TNF-α、NF-κB、IκBα 以细胞核中可见棕黄或棕褐色颗粒为阳性表达。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用方差分析，进一步两两比较采取LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠药物干预前后体重比较

各组大鼠药物干预前体重比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。各组大鼠药物干预28 d 后体重比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；进一步两两比较，模型组的体重高于另外3 组（P＜0.05），西药组高于联合组和对照组（P＜0.05），联合组高于对照组（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠药物干预前及药物干预28 d后的体重比较（n=20，g，±s）

表1 各组大鼠药物干预前及药物干预28 d后的体重比较（n=20，g，±s）

注：①与模型组比较，P ＜0.05；②与西药组比较，P ＜0.05；③与对照组比较，P ＜0.05。

药物干预28 d后210.78±10.33①②231.16±15.17 225.65±13.02①219.32±11.62①②③5.150 0.003组别对照组模型组西药组联合组F 值P 值药物干预前190.54±8.11 189.18±9.13 188.69±10.14 190.88±10.52 0.245 0.865

2.2 各组大鼠血清性激素水平比较

各组大鼠血清T、FSH、LH 水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；进一步两两比较，模型组血清T、FSH、LH 水平高于另外3 组（P＜0.05），西药组高于联合组与对照组（P＜0.05），联合组高于对照组（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠血清性激素水平比较 （n=20，±s）

表2 各组大鼠血清性激素水平比较 （n=20，±s）

注：①与模型组比较，P ＜0.05；②与西药组比较，P ＜0.05；③与对照组比较，P ＜0.05。

LH/（mIU/mL）34.51±6.78①②47.15±11.63 43.12±10.97①39.22±7.56①②③6.512 0.001组别对照组模型组西药组联合组F 值P 值T/（ng/dL）11.91±2.26①②17.5±5.76 15.87±4.98①13.66±4.21①②③5.999 0.001 FSH/（mIU/mL）9.94±2.82①②14.79±4.63 13.08±3.99①11.71±3.41①②③6.343 0.001

2.3 各组大鼠TNF-α、NF-κB、IκBα 蛋白相对表达量比较

各组大鼠卵巢组织TNF-α、NF-κB、IκBα 蛋白相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较，模型组大鼠卵巢组织TNF-α、NF-κB 蛋白相对表达量高于另外3 组，IκBα 蛋白相对表达量低于另外3 组（P＜0.05）；西药组大鼠卵巢组织TNF-α、NF-κB 蛋白相对表达量高于联合组与对照组（P＜0.05），同时联合组高于对照组（P＜0.05）；西药组大鼠卵巢组织IκBα 蛋白相对表达量低于联合组与对照组（P＜0.05），同时联合组低于对照组（P＜0.05）。见图1 和表3。

表3 各组大鼠卵巢组织TNF-α、NF-κB、IκBα蛋白相对表达量的比较 （n=20，±s）

表3 各组大鼠卵巢组织TNF-α、NF-κB、IκBα蛋白相对表达量的比较 （n=20，±s）

注：①与模型组比较，P ＜0.05；②与西药组比较，P ＜0.05；③与对照组比较，P ＜0.05。

IκBα蛋白相对表达量0.71±0.22①②0.46±0.12 0.55±0.16①0.61±0.20①②③6.495 0.001组别对照组模型组西药组联合组F 值P 值TNF-α蛋白相对表达量0.38±0.07①②1.45±0.21 1.13±0.19①0.67±0.14①②③6.416 0.001 NF-κB蛋白相对表达量0.53±0.18①②0.81±0.26 0.73±0.24①0.64±0.20①②③5.867 0.001

图1 各组大鼠卵巢组织TNF-α、NF-κB、IκBα蛋白的表达

2.4 各组大鼠TNF-α、NF-κB、IκBα mRNA 相对表达量的比较

各组大鼠卵巢组织TNF-α、NF-κB、IκBα mRNA 相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较，模型组大鼠卵巢组织TNF-α、NF-κB mRNA 相对表达量高于另外3 组，IκBα mRNA 相对表达量低于另外3 组（P＜0.05）；西药组大鼠卵巢组织TNF-α、NF-κB mRNA 相对表达量高于联合组与对照组（P＜0.05），联合组高于对照组（P＜0.05）；西药组大鼠卵巢组织IκBα mRNA 相对表达量低于联合组与对照组（P＜0.05），联合组低于对照组（P＜0.05）。见表4。

表4 各组大鼠TNF-α、NF-κB、IκBα mRNA相对表达量比较 （n=20，±s）

表4 各组大鼠TNF-α、NF-κB、IκBα mRNA相对表达量比较 （n=20，±s）

注：①与模型组比较，P ＜0.05；②与西药组比较，P ＜0.05；③与对照组比较，P ＜0.05。

TNF-α mRNA 0.67±0.21①②1.01±0.34 0.90±0.29①0.76±0.24①②③5.990 0.001组别对照组模型组西药组联合组F 值P 值NF-κB mRNA 0.53±0.18①②0.83±0.24 0.72±0.20①0.61±0.19①②③6.498 0.001 IκBα mRNA 0.58±0.20①②0.39±0.11 0.44±0.13①0.52±0.15①②③6.750 0.001

2.5 各组大鼠卵巢组织TNF-α、NF-κB、IκBα 的OD值比较

各组大鼠卵巢组织TNF-α、NF-κB、IκBα 的OD 值比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较，模型组大鼠卵巢组织TNF-α、NF-κB 的OD 值高于另外3 组，IκBα 的OD 值低于另外3 组（P＜0.05）；西药组大鼠卵巢组织TNF-α、NF-κB 的OD 值高于联合组与对照组（P＜0.05），联合组高于对照组（P＜0.05）；西药组大鼠卵巢组织IκBα 的OD 值低于联合组与对照组（P＜0.05），联合组低于对照组（P＜0.05）（见表5）。各组大鼠卵巢组织TNF-α、NF-κB、IκBα 阳性表达见图3～5。

表5 各组大鼠卵巢组织TNF-α、NF-κB、IκBα的OD值比较 （n=20，±s）

表5 各组大鼠卵巢组织TNF-α、NF-κB、IκBα的OD值比较 （n=20，±s）

注：①与模型组比较，P ＜0.05；②与西药组比较，P ＜0.05；③与对照组比较，P ＜0.05。

IκBα 0.78±0.24①②0.44±0.16 0.59±0.17①0.67±0.19①②③6.302 0.001组别对照组模型组西药组联合组F值P值TNF-α 0.40±0.14①②0.76±0.23 0.65±0.21①0.52±0.16①②③11.165 0.001 NF-κB 0.49±0.15①②0.74±0.23 0.66±0.21①0.58±0.17①②③6.195 0.001

图3 各组大鼠卵巢组织TNF-α蛋白阳性表达 （免疫组织化学×200）

图4 各组大鼠卵巢组织NF-κB蛋白阳性表达 （免疫组织化学×200）

图5 各组大鼠卵巢组织IκBα蛋白阳性表达 （免疫组织化学×200）

3 讨论

研究发现[7]，PCOS 易增加子宫内膜癌的发病风险，积极治疗PCOS 对女性月经失调、不孕症及各种远期并发症有较好的预防作用。由于对PCOS发病机制认识的局限性，目前国内外尚无统一的规范治疗方案，临床治疗多以促排卵等对症处理为主，但存在停药复发或治疗无效等问题。西药基础上联合中医药治疗PCOS 具有不良反应少，且能有效改善患者症状，受到临床欢迎。

3.1 自拟补肾祛瘀方对PCOS 大鼠性激素水平的影响

本研究通过来曲唑法复制大鼠PCOS 模型。来曲唑可促进促性腺激素持续分泌，刺激LH、FSH持续合成，使LH、FSH 无法达到排卵高峰，诱发排卵功能障碍，造成卵巢多囊样改变[8]。本研究结果显示，药物干预后，模型组大鼠体重增加最为显著，高于另外3 组；西药组高于联合组和对照组，联合组高于对照组。此外，模型组血清T、FSH、LH 高于对照组；且与模型组相比，血清T、FSH、LH 明显降低，其中联合组更低，但仍高于对照组。这提示PCOS 会造成血清T、FSH、LH 水平的升高，西药治疗可促进血清T、FSH、LH 降低，而联合自拟补肾化瘀方治疗后，血清T、FSH、LH 会进一步降低。中医认为[9]，PCOS 病机主要为肾虚、瘀血阻致胞宫，两者互为因果，形成肾虚血瘀症，补肾化瘀是PCOS 的主要治疗思路。本研究所用自拟补肾化瘀方中，菟丝子、山茱萸补肾益精为君药，女贞子、墨旱莲共用为臣药，可养肝肾、益精血；丹参、赤芍、桃仁活血养血为佐药，补益而不留瘀；川芎、红花解郁通达、活血祛瘀，为使药。诸药合用精充血足、气血畅通则经自调，共奏补肾化瘀、活血调经之功[10-11]。现代药理学研究表明[12-13]，菟丝子可以TNF-α 为靶点调控TNF-α/NF-κB，抑制PCOS 的炎症反应，从而治疗PCOS；墨旱莲具有抗炎、调节免疫等功效，可通过对卵巢炎症的抑制作用改善卵巢功能[14-15]；山茱萸的抗炎抑菌作用可有效改善PCOS 大鼠的胰岛素抵抗，从而减轻炎症及氧化应激，降低血清TNF-α 水平，促进卵巢功能的恢复[16]；丹参可通过对外周血单个核细胞NF-κB 活化及TNF-α 表达的影响来调控炎症反应，且与NF-κB/IκBα 炎症反应通路之间存在量效时效关系[17-18]。上述研究提示自拟补肾祛瘀方可能是通过对TNF-α/NF-κB/IκBα 炎症通路的调控来改善卵巢循环与病理状态，达到治疗目的。

3.2 自拟补肾祛瘀方对PCOS 大鼠TNF-α/NF-κB/IκBα 信号通路的调控作用

为探讨自拟补肾祛瘀方治疗PCOS 的机制，本研究检测大鼠卵巢组织的TNF-α、NF-κB、IκBα表达，结果显示模型组大鼠卵巢组织的TNF-α、NF-κB 蛋白表达，mRNA 表达，OD 值均高于对照组，IκBα 蛋白表达，mRNA 表达，OD 值均低于对照组。与模型组相比，西药组和联合组卵巢组织TNF-α、NF-κB 蛋白表达，mRNA 表达，OD 值均降低，其中联合组更低，但仍高于对照组；与模型组相比，西药组和联合组卵巢组织IκBα 蛋白表达，mRNA 表达，OD 值均升高，其中联合组更高，但仍低于对照组。上述结果表明自拟补肾化瘀方治疗PCOS 可上调卵巢组织TNF-α、NF-κB 表达，下调IκBα 表达，PCOS 发病与NF-κB/IκBα 信号通路有关。国外研究表明[19]，细胞在正常生理情况下，NF-κB 与抑制蛋白IκBα 结合成无活性的三聚体并存在于细胞质中；TNF-α 升高会刺激IκBα 磷酸化后与NF-κB 解离，使NF-κB 进入细胞核并转录，诱发PCOS[20]。也有研究发现[21]，炎症因子IκBα 是NF-κB/IκBα 信号通路的关键下游因子，抑制IκBα可阻断该通路，改善PCOS。自拟补肾化瘀方可补益肝肾，活血化瘀，切中病机，并通过影响TNF-α调控的IκBα/NF-κB 信号通路来改善卵巢功能，且可对TNF-α、IκBα、NF-κB 多个靶点进行干预，最终促进性激素水平的恢复。本研究不足之处：PCOS 的发病过程复杂，自拟补肾祛瘀方治疗PCOS可能不只对单一信号通路的调控发挥治疗作用，其可能涉及的其他信号通路及靶点仍有待进一步探究。

综上所述，自拟补肾化瘀方治疗PCOS 可有效促进LH、FSH、T 等的恢复，且这一作用考虑与TNF-α 介导的NF-κB/IκBα 信号通路的调控有关。