基于Nrf2/ARE信号通路探讨硫氢化钠对溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜损伤的影响*

陈泰宇，唐学贵，蒋小东，唐诗宇，陈思敏，李敏

（1.川北医学院附属医院 中西医结合肛肠科，四川 南充 637001；2.川北医学院附属医院泌尿外科，四川 南充 637001；3. 川北医学院，四川 南充 637100）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）是一种炎症性慢性肠病，临床表现为腹痛、腹泻、黏液脓血便、里急后重等，具有长期迁延、反复发作的特点[1]。UC 发病机制复杂多样，研究表明，免疫功能紊乱及炎症反应是UC 发生发展关键因素之一。临床主要采取对症治疗缓解UC 症状，且需长期服药，目前临床尚缺乏特异性治疗措施[2]。硫氢化钠（NaHS）是外源性气体信号分子硫化氢（H2S）的供体，吸收入血后能迅速转化成H2S，研究表明NaHS、H2S 具有抗炎、抗氧化应激作用[3]。梁慧洁等[4]、赫曼等[5]研究显示，NaHS 可抑制UC 小鼠肠黏膜损伤，对肠组织有保护作用，但具体作用机制尚未明确。核因子E2 相关因子2/抗氧化反应元件（Nrf2/ARE）是一条与炎症反应有关的信号通路，陈力等[6]研究显示，促进Nrf2/ARE 信号通路活化能够抑制炎症反应，进而对UC 小鼠发挥保护作用。目前有关NaHS 对UC 的保护作用是否与调控Nrf2/ARE 信号通路有关少见报道，因此本研究基于Nrf2/ARE 信号通路探究NaHS 对UC 大鼠肠黏膜损伤的保护作用，以期为临床探寻治疗UC 的特异性方式提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级SD 雄性大鼠45 只，9 周 龄，体重180～210 g，平均（195±15）g，购自北京唯尚立德生物科技有限公司，实验动物使用许可证号：SYXK（京）2021-0056，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2021-0010。

1.2 主要试剂与仪器

NaHS（纯度≥98%）购自美国Sigma 公司，柳氮磺胺吡啶（SASP）（国药准字H31020450）购自上海中西三维药业有限公司，2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）（纯度≥98%，规格20 mg）购自成都普菲德生物技术有限公司，苏木精-伊红（HE）染色试剂盒购自上海一研生物科技有限公司，白细胞介素-8（IL-8）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒均购自滁州仕诺达生物科技有限公司，兔抗鼠Nrf2、ARE、β-肌动蛋白（β-actin）多克隆抗体及山羊抗兔HRP 二抗均购自北京百普赛斯生物科技股份有限公司。Optima™XPN 超速离心机购自美国贝克曼库尔特生物科技有限公司，TENLIN-A型组织匀浆机购自江苏天祥仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 UC 大鼠模型复制随机选取10 只正常大鼠为对照组，另35 只大鼠进行模型复制[7]。TNBS 诱导的UC 大鼠模型复制方法：每日给予大鼠番泻叶、腺嘌呤分阶段灌胃，连续28 d，于第29 天禁食不禁水24 h，用5%水合氯醛（4 mL/kg）腹腔注射大鼠，麻醉后将其固定，在液状石蜡油润滑作用下用16 号灌胃针头从大鼠肛门经肠道逆行轻柔插入距肛门约8 cm 处，按体重100 mg/kg 的TNBS 加入等体积的50%乙醇制成混合液，充分混匀后注入大鼠结肠内，10 只对照组大鼠给予等量0.9%氯化钠溶液灌肠，后推入3 mL 空气；将大鼠提尾倒置3 min 后，使之平躺至自然清醒。模型复制期间观察大鼠一般情况，模型复制结束后从模型大鼠中随机选取5 只，从对照组大鼠中随机选取2 只麻醉处死，取结肠组织进行形态及病理学观察。模型复制成功大鼠可见皮毛稀疏无光泽，精神萎靡、慵懒，饮食减少，小便清长，大便溏泄且/或伴有黏液脓血便；结肠组织可见局部溃疡灶、糜烂、充血、水肿等；光学显微镜下可见结肠组织炎症细胞浸润、黏膜层缺损、腺体减少、排列紊乱等病理改变。

1.3.2 实验动物分组及处理模型复制过程中，3 只大鼠死亡，将剩余27 只模型复制成功的大鼠随机分为模型组、阳性对照组及硫氢化钠组，每组9 只。阳性对照组于模型复制成功后第3 天给予柳氮磺胺吡啶（SASP）混悬溶液0.5 g/（kg·d）灌胃给药[8]；硫氢化钠组大鼠于同时间腹腔注射1 mL 硫氢化钠溶液（100 μmol/L，1 次/d，连续7 d）[9]；模型组和对照组于同时间腹腔注射等量生理盐水。模型复制期间观察大鼠一般情况。

1.3.3 标本采集于末次给药结束后，大鼠禁食12 h，麻醉，腹主动脉取血，离心10 min（3 000 r/min，离心半径8 cm）取上清液，置入-20℃冰箱冷冻保存备用。取血结束后将大鼠麻醉处死，距肛门8 cm 处取结肠组织， 进行结肠黏膜损伤指数（colon macroscopic damage index, CMDI）评 分[10]：0 分（黏膜无损伤）、1 分（黏膜充血、水肿、无溃疡）、2 分（黏膜充血、水肿、轻度糜烂及无溃疡）；3 分（黏膜充血、水肿、中度糜烂及有单个溃疡）；4 分（黏膜充血、水肿、高度糜烂及有多处溃疡）；5 分（黏膜充血、水肿、重度糜烂及有＞1 cm 溃疡）；沿肠系膜缘剪开肠腔，用冰生理盐水清洗肠内容物，滤纸吸干，剪成两部分，一部分于4%多聚甲醛中固定，乙醇脱水、透明、石蜡包埋过夜，连续切片（6 μm 厚），用于HE 染色，另一部分置于-80℃冰箱冷冻保存，用于Western blotting 检测。

1.3.4 ELISA 法检测各组大鼠血清炎症因子水平取各组大鼠血清，分别采用ELISA 试剂盒检测大鼠血清IL-8、TNF-α 水平。在酶标板上加入稀释后的标准品50 μL+待测样品50 μL+生物素标记的抗体50 μL。盖上模板，轻轻振荡混匀，37℃温育1 h。甩去酶标板孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30 s，甩去洗涤液，用吸水纸拍干（共洗涤3 次）。每孔加入80 μL 的链霉亲和素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30 min。甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30 s，甩去洗涤液，用吸水纸拍干（共洗涤3 次）。每孔加入底物A、B 各50 μL，轻轻振荡混匀，37℃温育10 min（避光操作）。取出酶标板，迅速加入50 μL 终止液，立即在450 nm 波长处测定各孔的光密度值[11]。

1.3.5 HE 染色观察大鼠结肠组织病理学变化取各组大鼠结肠组织切片，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min 进行脱蜡处理，用梯度浓度乙醇100%、90%、80%、70%各处理5 min，自来水冲洗5 min，重复冲洗3 次。用苏木精染色5 min（根据染色情况可以适当延长或缩短染色时间），结束后用流水冲洗。用伊红染色1 min（根据染色情况可以适当延长或缩短染色时间），结束后用流水冲洗。用梯度浓度乙醇70%、80%、90%、100%各处理10 s，二甲苯处理1 min，自然晾干再封后滴上中性树胶封片（用吸管滴上1 滴即可，尽量少滴，但压片后要将组织全部覆盖完，避免中间有气泡）。光学显微镜观察并采集图片，使用Image-Pro Plus 6.0 软件观察大鼠结肠组织病理学变化[12]。

1.3.6 Western blotting 检测大鼠结肠组织中Nrf2/ARE 信号通路蛋白水平的变化取各组大鼠结肠组织并制备匀浆，裂解，孵育20 min，离心10 min（3 000 r/min，离心半径8 cm）取上清液，测定蛋白总量并取20 μg 与等量上样缓冲液混匀，沸水浴变性，电泳、转膜，以5%脱脂奶粉封闭2 h，TBST 清洗，加入Nrf2、ARE 及内参β-actin 作为一抗（1∶500），4℃孵育过夜，TBST 洗涤，加入山羊抗兔二抗（1∶1 000），37℃1.5 h，显影、定影，以蛋白条带灰度值计算目标基因蛋白相对表达量[13]。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，两两比较用SNK-q检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况比较

对照组大鼠饮食、活动正常，精神状态良好，皮毛光亮，大便成形，肛周未见异常分泌物；模型组大鼠饮食减少，出现神态萎靡、精神慵懒，皮毛暗黄，弓背蜷缩喜扎堆，小便清长，大便质软，甚者稀溏，肛周见黏液脓血分泌物，部分大鼠出现腹部胀满；与模型组大鼠比较，硫氢化钠组及阳性对照组大鼠上述症状、体征有所改善。

2.2 各组大鼠血清炎症因子水平比较

对照组、模型组、阳性对照组及硫氢化钠组大鼠血清IL-8、TNF-α 水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05），与对照组比较，模型组、阳性对照组及硫氢化钠组IL-8、TNF-α 水平均升高（P＜0.05），与模型组比较，阳性对照组和硫氢化钠组大鼠血清IL-8、TNF-α 水平均降低（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血清炎症因子水平比较 （±s）

表1 各组大鼠血清炎症因子水平比较 （±s）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与模型组比较，P ＜0.05。

组别对照组模型组阳性对照组硫氢化钠组F 值P 值TNF-α/（μg/L）86.73±13.09 135.77±20.37①106.50±15.98①②105.23±15.79①②12.802 0.000 n 8 9 9 9 IL-8/（ng/L）2.16±0.33 6.56±0.98①4.50±0.68①②4.53±0.69①②53.116 0.000

2.3 模型组、阳性对照组及硫氢化钠组大鼠结肠黏膜组织CMDI评分比较

模型组、阳性对照组及硫氢化钠组大鼠结肠组织CMDI 评分分别为（4.87±0.73）分、（2.15±0.32）分、（2.08±0.35）分，3 组比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=90.186，P=0.000），与模型组比较，阳性对照组和硫氢化钠组大鼠结肠黏膜组织CMDI 评分降低（P＜0.05）。

2.4 各组大鼠结肠组织病理学变化

对照组大鼠结肠组织结构完整，腺体排列整齐，无炎症细胞浸润，未见水肿、充血、糜烂、溃疡等情况；模型组大鼠结肠黏膜上皮缺损，腺体排列紊乱且减少，明显可见黏膜水肿、充血，有大量炎症细胞浸润，有溃疡灶形成；阳性对照组、硫氢化钠组大鼠结肠组织黏膜上皮部分缺损，腺体排列尚规则，充血、水肿较轻，伴有少量炎症细胞浸润。见图1。

图1 各组大鼠结肠组织病理学变化 （HE×200）

2.5 各组大鼠结肠组织Nrf2/ARE通路蛋白相对表达量比较

对照组、模型组、阳性对照组及硫氢化钠组大鼠结肠组织Nrf2、ARE 蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05），与对照组比较，模型组、阳性对照组及硫氢化钠组Nrf2、ARE 蛋白相对表达量均降低（P＜0.05），与模型组比较，阳性对照组和硫氢化钠组大鼠结肠组织Nrf2、ARE 蛋白相对表达量均升高（P＜0.05）。见表2 和图2。

图2 各组大鼠结肠组织Nrf2/ARE信号通路蛋白表达

表2 各组大鼠结肠组织Nrf2/ARE信号通路蛋白相对表达量比较 （±s）

表2 各组大鼠结肠组织Nrf2/ARE信号通路蛋白相对表达量比较 （±s）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与模型组比较，P ＜0.05。

组别对照组模型组阳性对照组硫氢化钠组F 值P 值ARE蛋白1.09±0.16 0.30±0.06①0.75±0.12①②0.73±0.11①②66.078 0.000 n 8 9 9 9 Nrf2蛋白1.15±0.18 0.23±0.03①0.66±0.09①②0.68±0.11①②93.695 0.000

3 讨论

UC 是一种病因不明的炎症性慢性肠病，具有慢性过程和反复发作的特征，发病机制尚未明确，目前临床仍缺乏特异性治疗手段。BERCIER 等[14]研究显示，NaHS 能够抑制炎症反应进而抑制慢性结肠炎肠壁纤维化进展。本文探究NaHS 对UC 结肠损伤的影响，并分析其可能的机制，以期为临床探寻有效治疗UC 的特异性方法提供一定依据。

IL-8、TNF-α 是炎症因子，参与机体的炎症反应，与UC 密切相关[15]。本研究成功复制UC 大鼠模型，结果显示，模型组大鼠饮食减少，出现神态萎靡、精神慵懒、皮毛暗黄、大便质软、肛周见黏液脓血分泌物等症状，部分大鼠出现腹部胀满等UC 典型症状。当以NaHS 干预后，上述症状有所改善，与对照组比较，模型组、阳性对照组及硫氢化钠组IL-8、TNF-α 水平均升高，与模型组比较，阳性对照组和硫氢化钠组大鼠血清IL-8、TNF-α 水平均降低，说明NaHS 可能减轻UC 大鼠炎症反应，对结肠黏膜组织损伤发挥保护作用。CMDI 评分可用于评价肠黏膜损伤程度，评分越高，肠黏膜损伤越严重[16]。本研究结果显示，NaHS 干预后，阳性对照组和硫氢化钠组大鼠结肠黏膜组织CMDI 评分较模型组降低，说明NaHS 可能减轻UC 大鼠炎症反应，进而对大鼠结肠黏膜损伤发挥保护作用。

Nrf2/ARE 是一条与炎症反应相关的信号通路，正常生理情况下，Nrf2 与受Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白1（Keap1）结合形成异源二聚体，Nrf2 表达处于基础水平，当受到氧化应激等各种刺激后，Nrf2 与Keap1 结合部位发生解离，进而使Nrf2 进入细胞核，与ARE 结合，抑制核内氧自由基的产生，最终抑制氧化应激炎症损伤[17-18]。马旭冉等[19]研究显示，促进Nrf2 通路活化能够有效抑制UC 大鼠结肠组织氧化应激反应进而抑制炎症反应，对UC 大鼠结肠组织损伤发挥保护作用。本研究结果显示，与对照组比较，模型组、阳性对照组及硫氢化钠组Nrf2、ARE 蛋白相对表达量均降低，与模型组比较，阳性对照组和硫氢化钠组大鼠结肠组织Nrf2、ARE 蛋白相对表达量均升高。说明NaHS 可能通过促进Nrf2/ARE 信号通路活化抑制炎症反应，进而对UC 大鼠结肠黏膜损伤发挥保护作用。

综上所述，NaHS 对UC 大鼠结肠黏膜损伤发挥保护作用，可能是通过促进Nrf2/ARE 信号通路活化抑制炎症反应实现的，可为临床探寻有效治疗UC 的特异性方法提供一定参考。本研究并未能明确NaHS 对Nrf2/ARE 信号通路的具体调控作用，后期应进行深入阐述。