霍山石斛药渣中多糖的提取、乙醇分级沉淀、纯化和分子量测定

徐海军，杨 洋，董雅琪，李天宇，张娅菲,爨淑楠，邓 辉，郝经文，戴 军

(1.皖西学院 生物与制药工程学院，安徽 六安 237012；2.安徽省中药资源保护与持续利用工程实验室，安徽 六安 237012)

霍山石斛(俗称米斛)是安徽省六安市霍山县道地名贵中药材[1]，其形如累米，根粗顶细，每节仅米粒长短，成熟后长度不超过10 cm。唐开元年间，道家《道藏》曾将霍山石斛、天山雪莲、三两人参、百二十年首乌、花甲之茯苓、苁蓉、深山灵芝、海底珍珠、冬虫夏草等列为“中华九大仙草”，而霍山石斛名列其首[2]。《神农本草经》将霍山石斛列为上品仙草[3]。除了作为药品使用外，霍山石斛也一直作为保健食品原料来使用。2019年9月《霍山石斛茎(人工种植)》安徽省食品安全地方标准正式发布，使霍山石斛作为食品原料应用有了“合法”身份。多糖是霍山石斛的重要药效成分，具有抗氧化、抗白内障、抗肝损伤和肝纤维化、抗疲劳、调节免疫力、抗肿瘤、抗糖基化等药理作用[4-8]。为了确定某制药厂霍山石斛经无水乙醇和水依次提取一次后剩下药渣中的多糖含量及其组成特点，本项目提取、纯化药渣中的多糖，并用不同浓度乙醇对提取的多糖进行分级沉淀，测定了含量最多的40%醇沉多糖及其盐酸水解物的分子量分布，以便为充分利用宝贵的霍山石斛资源提供实验依据。

1 材料

1.1 试剂

霍山石斛药渣(由某药厂提供，霍山石斛干茎依次经无水乙醇和水提取一次后剩余的药渣)；葡萄糖(国药集团化学试剂有限公司)；猪胰淀粉酶(酶活≥50 U/mg，合肥博美生物科技有限责任公司)；氯仿、正丁醇、无水乙醇、丙酮、苯酚、浓硫酸、盐酸、磷酸、氢氧化钠、硝酸钠等均为国产分析纯试剂。透析袋(MWCO3500 D，北京索莱宝科技有限公司)；DEAE-32纤维素(粒径50 um，吸附载量180 mg HSA，北京瑞达恒辉科技发展有限公司)。

1.2 仪器

DD5台式大容量低速离心机(湖南赫西仪器装备有限公司)、数显恒温水浴锅(HH-4型，常州国华电器有限公司)、电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9140 A型，上海一恒科技有限公司)、电子分析天平(FA1204 B型，上海越平科技仪器有限公司)、旋涡混匀器(HYQ-2121A型，苏州捷美电子有限公司)、冷冻干燥机(FD-1A-50型，北京博医康实验仪器有限公司)、旋转蒸发仪(RE-52 AA型，上海亚荣生化仪器厂)、SHB-Ⅲ循环水多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)、紫外可见分光光度计(TU-1901型，北京普析通用仪器有限公司)、pH计(PHS-3C型，上海仪电科学仪器股份有限公司)、ELEOS System型凝胶渗透色谱仪(美国Wyatt公司)、色谱柱(Shodex OHpak系列 SB-806串803，日本昭和电工株式会社)。

2 方法

2.1 药渣中霍山石斛总多糖的提取、脱淀粉和脱蛋白

参照余刚等的方法[8]，将霍山石斛药渣在65 ℃干燥箱中烘6小时，取出冷却后用万能粉碎机粉碎，过40目筛。每次称取20 g药渣粉末，装在三角瓶中，按1∶40体积加入800 mL蒸馏水，85 ℃水浴加热2小时，其间进行多次振摇。水浴加热结束后取出，冷却后将水煮液用4层纱布过滤，取滤液。滤渣挤干后重新加1:40体积蒸馏水再水浴加热2小时。这样反复提取3次。合并3次滤液，4000 rpm离心10 min。取上清，80 ℃旋转蒸发浓缩至1050 mL。加入4倍体积无水乙醇，使溶液乙醇终浓度为80%，4 ℃冷藏过夜，使多糖充分析出，再用8层纱布过滤(过滤时可用手挤压以加快过滤速度)，滤渣用95%乙醇洗涤2次，挥干。

将挥干的霍山石斛粗多糖用蒸馏水溶解，配成1%浓度。参照李娅等的方法(略加修改)脱淀粉[9]，即在1%霍山石斛粗多糖溶液中加入胰淀粉酶(终浓度为15 IU/mL)，40 ℃水解80 min。水解结束后沸水浴加热5 min灭活淀粉酶，冷却至室温后，用Sevage法脱蛋白(重复5次)[8]，再用80%乙醇沉淀，沉淀分别用95%乙醇和丙酮洗2次，挥干后得霍山石斛精制总多糖，称重，计算多糖提取率。

2.2 霍山石斛多糖乙醇分级沉淀

将上述制备的霍山石斛总多糖用蒸馏水配成1%溶液。参照文献[10]和[11]方法(略加修改)进行乙醇分级沉淀。先加入无水乙醇使多糖溶液的乙醇终浓度为30%，轻摇混匀后4 ℃冷藏过夜，8000 rpm 4 ℃离心10 min，取上清。在上清中加入无水乙醇使多糖溶液的乙醇终浓度为40%，轻摇混匀后4 ℃冷藏过夜，8000 rpm 4℃离心10 min，取沉淀，得40%醇沉霍山石斛多糖，将其切成小块摊在保鲜膜上20 ℃挥干。同法依次制备50%、60%、70%、80%醇沉霍山石斛多糖。根据分级沉淀结果，选取所占比例最高的40%醇沉多糖进行进一步纯化。

2.3 40%醇沉霍山石斛多糖DEAE32层析、透析纯化

将40%醇沉霍山石斛多糖配成2%浓度。用DEAE32柱进行层析，每次上样体积为2 mL。用蒸馏水进行洗脱。流速为2.5 mL/min。每管收集10 mL洗脱液，用苯酚-硫酸法定性监测每管洗脱液中多糖含量，即从每管洗脱液中取100 uL样品，加入200 uL 5%苯酚，再加入1 mL浓硫酸，肉眼观察洗脱液颜色变化，如果溶液呈黄色则表明其中含有多糖。对含有多糖的洗脱液收集管，进一步用苯酚-硫酸法[12]测定多糖含量(以OD490值表示)，绘制洗脱曲线。

将含有多糖的洗脱液合并，80 ℃旋转蒸发浓缩至有一定黏度后，用截留分子量为3400 Da的透析袋透析。先用自来水流动透析24小时；然后换成蒸馏水静止透析12小时，再换一次蒸馏水，继续透析12小时。透析结束后，将透析液装在干净的培养皿内，冷冻后用真空冷冻干燥机冻干。

2.4 40%醇沉霍山石斛多糖中淀粉含量定性鉴定、蛋白含量和多糖含量测定

2.4.1 40%醇沉霍山石斛多糖中淀粉含量定性鉴定

参照李娅等的方法(略作修改)[9]，称取适量40%醇沉霍山石斛多糖溶于蒸馏水中，配成1 mg/mL浓度的多糖溶液。取50 μL样品溶液，滴在干净的培养皿中，再滴入 200 μL碘试剂(含 0.02%碘的0.2%碘化钾溶液)，观察颜色变化，用0.1%可溶性淀粉溶液作阳性对照。

2.4.2 40%醇沉霍山石斛多糖中蛋白含量测定

参照乔德亮[13]的方法，称取100 mg 考马斯亮蓝 G-250，溶于50 mL 95%乙醇，加入 100 mL 85%的磷酸，蒸馏水定容至 1 L，备用。精确配制 0.1 mg/mL 牛血清白蛋白标准溶液，分别取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 的标准液，用蒸馏水补充至 1 mL，加入 5 mL 考马斯亮蓝 G-250，混匀，放置 10 min。595 nm 波长下测吸光度，根据测定结果制作标准曲线及回归方程。

40%醇沉霍山石斛多糖中蛋白质含量测定：取3支试管，分别加入1mL 1mg/mL 多糖样品溶液，再加入 5mL 考马斯亮蓝 G-250，混匀，放置 10 min。595nm 波长下测吸光度。根据回归方程计算出蛋白含量，取三管平行测定的平均值。

2.4.3 40%醇沉霍山石斛多糖中多糖含量测定

采用苯酚-硫酸法测定多糖含量[12]。准确称取0.1 g烘干至恒重的葡萄糖，用蒸馏水定容至100 mL，得1 mg/mL葡萄糖溶液；用10 mL吸管从中取10 mL，定容至100 mL，得0.1 mg/mL 葡萄糖溶液，分别取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 的标准液加到10 mL塑料有盖离心管中，用蒸馏水补至 1 mL，加入1 mL 5%苯酚溶液，再加入5 mL 浓硫酸，立即盖上盖子，涡旋混匀，静置20 min，在冷水中冷却，用空白管调零，490 nm 波长测吸光度。根据测定结果制作标准曲线及回归方程。取3支试管，分别加入1 mL 0.1 mg/mL 多糖样品溶液，参照上述方法测定多糖含量。根据回归方程计算出样品多糖含量，取三管平行测定的平均值。

2.5 40%醇沉霍山石斛多糖及其水解物分子量测定

参照李凡的方法[14]，将50 mL 40%醇沉霍山石斛多糖溶液(40 mg/mL)加到2 L 0.1 mol/L盐酸溶液中，调pH至1.0，多糖终浓度为1 mg/mL，37 ℃水解 1 h 后，用氢氧化钠调 pH 至中性，透析除盐后真空冷冻干燥获得40%醇沉霍山石斛多糖水解物。

将40%醇沉霍山石斛多糖及其水解物样品分别用超纯水配成0.1 mg/mL浓度，用0.22 uL滤膜过滤后上样检测。色谱条件：检测器：激光检测器(LS)和示差检测器(DRI)；流动相：水+0.02% NaN3；流速：1 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：500 uL。

3 结果

3.1 霍山石斛药渣中多糖提取率

经测定，霍山石斛药渣多糖的提取率为12%。表明仅经无水乙醇和水依次提取1次的霍山石斛药渣中仍含有较多的多糖。

3.2 霍山石斛多糖分级醇沉结果

霍山石斛多糖用不同浓度乙醇分级沉淀后得到各组分多糖占总多糖的比例见表1。从表1可见，40%醇沉的多糖所占总多糖的比例最大，达到51.5%；其次为50%乙醇沉淀的多糖，达到24.9%。乙醇浓度超过60%后沉淀的多糖所占比例均较小。因此，后续主要对占比最大的40%醇沉多糖进行研究。

3.3 40%醇沉霍山石斛多糖DEAE-32层析时蒸馏水洗脱曲线

1%浓度40%醇沉霍山石斛多糖溶液经DEAE-32层析，以蒸馏水为洗脱剂，每管收集洗脱液10 mL，前9管收集液用苯酚-硫酸法监测多糖时没有颜色变化，第10管时出现黄色，然后颜色逐渐变深，第16管时颜色变浅，第17管颜色又变深，第18管后颜色渐渐变浅，第23管时基本无色。获得的洗脱曲线见图1。从图1可见，40%醇沉霍山石斛多糖用DEAE-32层析、蒸馏水洗脱时可出现一个主要的洗脱峰，峰顶略有波折。纯化的40%醇沉霍山石斛多糖冷冻干燥后呈疏松洁白海绵状物(见图2)。在用蒸馏水洗脱后，换用0.1～1 mol/L NaCl溶液洗脱时，基本未检测到多糖，说明40%醇沉霍山石斛多糖绝大部分为中性多糖。

表1 霍山石斛多糖分级醇沉结果

图1 40%醇沉霍山石斛多糖DEAE-32层析蒸馏水洗脱曲线

图2 冷冻干燥的40%醇沉霍山石斛多糖样品

3.4 40%醇沉霍山石斛多糖样品中淀粉含量定性鉴定结果

采用碘试剂法定性鉴定40%醇沉霍山石斛多糖中的淀粉含量，结果表明1%浓度的40%醇沉霍山石斛多糖遇碘试剂后不显紫红色，而1%可溶性淀粉溶液(阳性对照)遇碘试剂后呈紫红色，表明纯化的40%醇沉霍山石斛多糖基本不含淀粉(见图3)。

图3 40%醇沉霍山石斛多糖样品中淀粉含量定性鉴定结果注：图中A和B分别为阳性对照和样品。

3.5 40%醇沉霍山石斛多糖中蛋白含量测定结果

采用考马斯亮蓝法获得的蛋白含量测定标准曲线回归方程为y=194.33x+1.6765(R2=0.9944)。根据回归方程计算得到40%醇沉霍山石斛多糖样品中蛋白含量为0.78%。

3.6 40%醇沉霍山石斛多糖中多糖含量测定结果

采用苯酚-硫酸法测定40%醇沉霍山石斛多糖样品中多糖含量，获得的葡萄糖浓度标准曲线回归方程为y=106.66x，R2=0.9998。根据回归方程计算得到样品中多糖含量约为90.61%。

3.7 40%醇沉霍山石斛多糖分子量测量结果

40%醇沉霍山石斛多糖重均分子量(Mw)为6万，数均分子量(Mn)为5.3万。Mw/Mn=1.136，说明40%醇沉霍山石斛多糖分子大小相对较均一。分子量分布结果(见表2)表明49%的多糖分子量在4万～4.8万，47.2%的多糖分子量在4.8万～13万，另有3.8%的多糖分子量在13万～22万。说明40%醇沉霍山石斛多糖的分子量总体上相对较小。

表2 40%醇沉霍山石斛多糖分子量分布

40%醇沉霍山石斛多糖水解物重均分子量(Mw)为2.4万，数均分子量(Mn)为0.59万。Mw/Mn=4.1，说明水解物中的多糖分子大小很不均一。40%醇沉霍山石斛多糖水解物分子量分布情况见表3。从表3可知，40%醇沉霍山石斛多糖经盐酸适度水解后，其分子量急剧降低，其63.9%的多糖分子量在0.13万～0.8万，30.2%的多糖分子量在0.8万～7.8万，分子量超过7.8万的多糖只有5.9%。

表3 40%醇沉霍山石斛多糖水解物分子量分布

4 讨论

霍山石斛中的多糖含量一般为17%～28%左右[6]。本研究发现霍山石斛药渣中残留有较为可观的多糖，其含量达到12%。但这些多糖的分子量相对较小，例如所占比例最高的40%醇沉霍山石斛多糖重均分子量(Mw)只有6万。邓辉报道霍山石斛多糖中有52.34%的多糖重均分子量小于1万[15]，21.83%的多糖重均分子量在1万～5万，重均分子量在5万～20万的多糖占16.38%，重均分子量在20万～50万的多糖占6.31%，重均分子量大于50万的多糖占3.14%。秦丹阳等研究发现[16]，霍山石斛多糖在1—4月及10—12月主要由两个组分构成，组分1的分子量在9.6万～53.8万，组分2的分子量在2.7万～9.97万，而在5—9月份(夏季)只存在高分子量的组分1，低分子量的组分2基本消失。郝杰等测得霍山石斛总多糖的重均分子量(Mw)为25.2万[17]，用40%、50%、60%和80%的乙醇对霍山石斛总多糖分级沉淀，分别获得重均分子量(Mw)为47.9万、31.6万、30.7万和8.59万的多糖。李明智等发现铁皮石斛纯多糖及其分级组分均主要为中性糖[18]，并且纯多糖和30%、40%、50%乙醇分级沉淀获得的多糖分子量分别为26.2万、31.5万、24.8万、20.3万，50%乙醇沉淀上清中的多糖分子量为13.6万，且各组分均一性良好。这些研究结果表明不同浓度乙醇能沉淀多大分子量的多糖似乎没有特定数值限定，可能还同时受到多糖分子量大小以外的其他因素(例如多糖的空间结构、极性大小等)的影响。鉴于乙醇分级沉淀在分离不同分子量大小多糖中具有成本低、效率高、便于产业化应用的优势，仍有必要深入研究完善该技术在制备高生物活性多糖中的应用。

分子量大小是影响多糖药理活性的重要因素之一[19-22]。因为分子量越大的多糖其分子体积也越大，以致不利于跨膜进入生物体内，而影响其生物活性的发挥，相反，多糖的分子量越小则容易与活性位点结合，但是如果分子量过小又不利于形成聚合结构[23]。研究表明分子量在5万～20万的多糖可能具有显著的抗肿瘤活性[24，25]。因此，本研究中40%醇沉霍山石斛多糖的重均分子量(Mw=6万)仍在此范围内，理论上依然具有较好的药理活性。

对于大分子多糖，采取适当方法降低其分子量，可以提高其生物活性[26]。江曙等研究表明黄蜀葵茎叶多糖的自由基降解产物可提高免疫活性[27]。江曙等还报道原本无明显免疫调节活性的黄蜀葵茎叶多糖经盐酸适度水解后[28]，可生成有显著免疫调节活性的多糖。李凡报道霍山石斛多糖DHP-2A经盐酸水解后可生成稳定的可吸收多糖片段[14]。本研究表明40%醇沉霍山石斛多糖用盐酸水解后调pH至中性，旋转蒸发浓缩后多糖溶液呈乳白色，并在透析时在透析袋底部析出白色沉淀，而上清保持澄清。推测该白色沉淀为多糖中的蛋白质遇盐酸发生变性，然后在透析过程中因为溶液中盐的浓度渐渐降低，导致对变性蛋白颗粒的浮力效应丧失而使变性蛋白发生沉淀。李凡在制备盐酸水解石斛多糖时[14]，用的是纯化的霍山石斛多糖DHP-2A，其中不含有蛋白，所以未发生蛋白遇强酸变性和透析时析出沉淀的现象。有趣的是，40%醇沉多糖的分子量分布范围为4万～22万，但40%醇沉多糖水解物的分子量分布范围为0.26万～64.5万，后者的最大分子量反而显著增加。其原因尚不清楚。有可能是部分变性的糖蛋白缠绕在一起使多糖分子量增加。关于利用盐酸水解高分子量石斛多糖来提高其生物活性的适宜方法(例如适宜pH值、水解时间、水解温度等)还需更多的研究。

本研究制备的40%醇沉霍山石斛多糖样品中含有0.78%的蛋白质。这些微量的蛋白质可能属于糖蛋白，在用Sevage法脱蛋白时不易全部被去掉。然而，有研究表明霍山石斛中的糖蛋白对肝癌细胞的细胞毒活性强于纯的多糖[29]。这似乎提示霍山石斛多糖中保留一部分蛋白质对于增强其生物活性是有益的。因此在制备霍山石斛多糖时，不必苛求尽量脱除蛋白。

5 结论

霍山石斛药渣中残留有较高含量(12%)的多糖，但其分子量明显低于未提取前的霍山石斛。霍山石斛药渣中40%醇沉多糖占总多糖的比例最高，达到51.5%，其重均分子量为6万，尚属于活性高的多糖分子量范围。用盐酸水解后可使大部分40%醇沉霍山石斛多糖分子量急剧降低，但有少量多糖分子量反而明显增加，具体原因还有待进一步研究。本研究结果为进一步开发利用霍山石斛药渣中的多糖资源提供了初步实验依据。