基于网络药理学探究柴胡-黄芩药对治疗高血压的作用机制

王森森，段启栋，鲍慧玮，田健

(长春中医药大学·吉林长春·130117)

高血压病又称原发性高血压病，是心血管疾病中较为常见的一种。主要临床表现为体循环动脉压升高所致的心脑血管综合征，常见症状有头晕、头痛、心悸、疲劳等[1]中医上高血压病属眩晕的范畴，多在中老年人中发生，其发病机制在于脏腑阴阳失调，肝阳上亢[2]，高血压是最常见的慢性病，也是心脑血管疾病最主要的危险因素，2019年全球有12.8亿成年人患高血压，我国成年人患高血压的人数为2.45亿，患病率普遍较低[3]，目前临床上以西药控制血压为主，高血压病人多需长期用药治疗，因此西药不良反应逐渐突出，使得一些高血压病人对药物治疗缺乏医从性，相对西药来说，中药虽然疗效缓慢，但作用确切，治疗效果好，容易为人们所接受[4]。

柴胡-黄芩药对来源于治疗少阳病的主方小柴胡汤，具有清热泻火、和解少阳的功效。柴胡性辛，味苦，性微寒。归肝胆经、肺经。具有疏散退热、疏肝解郁、升发阳气的功效。柴胡还具有治疗癌症、抗抑郁、抗炎、护心肝等多种药理活性，其中对高血压的治疗有重要的药理作用。柴胡中的栎皮素化学成分对心脏作用显著，主要通过抑制低密度脂蛋白氧化和非内皮依赖性血管舒张作用，起到预防神经元氧化和炎性损伤的作用，还可作为心血管疾病的治疗药物[5]，在氧化应激条件下对一氧化氮和内皮功能产生保护作用，减少黏附分子和其他炎性标记。柴胡中的有效成分—柴皂苷-D，对多项血脂指标均有不同程度的改善，能降低人体血压，减慢心率[6]。黄芩，性味苦寒，归肺经、胆经、小肠经等[7]，具有多种药理活性，如抗菌，护肝，抗肿瘤，抗氧化，保护心脑血管，保护神经系统等[8]。在黄芩化学成分中，对心脑血管有保护作用的有黄芩素、总黄酮等多种成分。其中，黄芩能维持心脏心肌细胞的功能，使之不受病理机制的影响，从而在改善细胞缺血、治疗高血压方面有一定的作用[9]，黄芩对多种原因引起的内皮细胞损伤有一定的保护作用，内皮细胞损伤是高血压、AS和血栓性疾病等共同发病的重要因素之一，黄芩中的黄芩化学成分能激活ACE2/ANG-(1-7)/MAS轴，通过促进内皮依赖的血管舒张，调节PI3K/AKT/ENOS信号通路，抑制AngⅡ诱导的氧化应激，从而治疗高血压[10]。

网络药理学是在现代药理学研究的基础之上提出的药物设计与开发的新方法和新策略，目前运用网络药理学验证柴胡-黄芩治疗高血压的作用机制少有报道，因此本研究采用网络药理学方法寻找柴胡-黄芩药对中具有类药性、口服吸收较好的成分,并预测这些成分治疗高血压的作用靶点及相关通路，为柴胡-黄芩的深入研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 柴胡-黄芩的活性成分及其作用靶点的筛选

利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），根据口服利用度（OB）%≥30%且类药性（DL）≥0.18作为阈值对结果进行筛选，分别查找柴胡、黄芩主要活性成分以及相关的潜在靶点。利用Uniprot（https://www.uniprot.org/）数据库将药物靶点转换成基因名称。

1.2 高血压疾病靶点的获取

以“hypertension”为关键词，分别在Genecards（https://www.genecards.org/）、Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）（https://omim.org/）、Drugbank（https://go.drugbank.com/）三个数据库中进行检索获取高血压相关的疾病靶点。将所得到的高血压靶点与药物靶点进行比对，筛选出疾病与药物的交集靶点，并且利用Venny2.1.0绘制柴胡-黄芩药对治疗高血压的韦恩图。

1.3 蛋白相互作用网络PPI的构建

将药物-疾病交集靶点导入STRING数据库，进行蛋白质互作(PPI)网络分析，物种选择Homo sapiens，获取靶点相互作用网络，导入Cytoscape 3.7.0软件进行PPI网络图的构建，以Degree数值高低来判断各种有效化合物靶标的重要性。Degree值越高，有效化合物及其靶标越重要。

1.4 药物-成分-疾病靶点网络图的构建

将药物、有效成分、靶点导入Cytoscape 3.7.0软件构建药物-成分-靶点网络图并利用Analyzer Network功能进行拓扑属性分析，以Degree数值高低来判断各种有效成分作用靶点的重要性。数值越高则表示该有效化合物及其作用靶点越重要。

1.5 GO功能和KEGG通路富集分析

将得到的交集靶点导入Metascape（metascape.org）数据平台，分别进行GO分子功能（GO Molecular Functions）、GO生物过程（GO Biological Processes）、GO细胞组分（GO Cellular Components）和KEGG通路富集分析，其中GO Biological Processes富集分析可以描述基因产物可能行使的分子功能，GO Cellular Components富集分析可以描述基因产物所处的细胞环境，GO Molecular Functions富集分析可以描述基因产物所参与的生物学过程。使用微生信数据可视化网站（www.bioinformatics.com.cn/）分别制作GO、KEGG富集气气泡图以及三合一柱状图。

2 结果

2.1 候选化合物与靶点的筛选

TCMSP数据库中筛选的到柴胡有效成分17个，黄芩的有效成分36个，得到靶点柴胡149个，黄芩89个。柴胡-黄芩有效成分如表1所示。

2.2 慢性咳嗽疾病靶点的收集

在Genecards数据库中获得高血压疾病靶点4056个，在OMIM数据库中获得92个疾病靶点，在Drugbank数据库中获得59个疾病靶点，三个数据库汇总去重之后共获得49个疾病靶点。三个数据库汇总去重之后共获得4103个疾病靶点，与药物靶点做交集后得到488个靶点，去重之后得到148个交集靶点。利用微生信网站（http://www.bioinformatics.com.cn/）将高血压疾病靶点与柴胡-黄芩药物靶点导入，制作Venn图，详见图1。

图1 柴胡-黄芩治疗高血压Venn图

2.3 PPI网络及核心靶点筛选与分析

将71个靶蛋白导入STRING数据库分析后得到蛋白质互作关系，利用Cytoscape 3.7.0软件构建蛋白质相互作用关系网络。将各个靶点通过Degree值大小进行排序（表2），Degree值越大则说明含有的靶点数越多，该蛋白质越重要。通过Degree值比较筛选出5个Degree值最高的核心靶点分别是苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）、肿瘤蛋白p53（TP53）、白细胞介素-6（IL6）、肿瘤坏死因子（TNF）、血管内皮生长因子A（VEGFA），这些靶点可能是柴胡-黄芩治疗高血压的关键核心靶点，详见图2。

表2 核心靶点

图2 PPI网络图

2.4 药物-活性成分-疾病靶点网络图的构建

将柴胡-黄芩药对中与高血压相关的活性成分交集靶点，运用Cytoscape 3.7.0绘制“药物-成分-靶点”网络图。计算图中每个节点的连接度(degree)。根据degree值排序，其程度越高,成分或靶点在网络中发挥的作用就越关键。其中Degree值较大的八个成分是槲皮素（quercetin）、豆甾醇（Stigmasterol）、山萘酚（kaempferol）、汉黄芩素 （wogonin）、黄芩素（baicalein）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、异鼠李素（isorhamnetin）、金合欢素（acacetin），详见图3。

图3 药物-成分-疾病靶点网络图

2.5 GO富集分析

将柴胡-黄芩药对治疗高血压的交集靶点导入基因富集分析网站Metascape进行GO富集分析，包括细胞组成(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)、生物过程(biological process，BP)三部分。以P＜0.05为筛选条件获得BP，MF，CC富集条目分别为1700,188,100条，将排名前十的生物过程、细胞组成和分子功能利用微生信在线平台绘制成柱状图及气泡图,详见图4、图5。

图4 GO功能富集分析柱状图

图5 GO功能富集分析气泡图

2.6 KEGG富集分析

利用Metascape网站对柴胡-黄芩药对治疗高血压的交集靶点进行KEGG富集分析分析结果显示共获得201条信号通路，据P值选取排名前十的通路,使用微生信数据可视化网站（www.bioinformatics.com.cn/）绘制气泡图，详见图6。

图6 KEGG通路富集分析气泡图

将KEGG通路及其对应靶点蛋白导入Cytoscape 3.7.0软件，制作KEGG通路-靶点网络图。与单位相连的线段越多，说明该单位Degree值越高，该通路或靶点越重要，详见图7。

图7 KEGG通路-靶点网络图

3 讨论

高血压是一种最主要的致终末期肾脏病的危险因素，是一种常见的危害人体健康的疾病，可造成严重的靶器官损害，如心和脑肾等[11]。高血压的发病机制主要涉及肾素-血管紧张素-醛固酮系统功能障碍、巨噬细胞极化、非编码RNA、下丘脑心血管中枢旁核区旁核炎性细胞因子、旁核活性氧簇、旁核肾素-血管紧张素系统、旁核因子B、旁核神经递质等，这些都是参与高血压疾病发生和发展的重要因素；焦虑使血管压力增大，血管阻力增大，容易导致血压升高；肠道菌群失调，通过调节血管收缩，调节植物神经和血管，调节免疫和炎症反应，最终导致血压升高，会导致腹痛、便秘、呕吐等；感染幽门螺杆菌可促进高血压的发生，其作用包括炎性反应，血脂代谢，免疫反应，同型半胱氨酸和胰岛素水平；血管紧张素II可能会影响胸腺功能和转录因子的表达，进而影响T淋巴细胞的平衡，最终造成内皮功能紊乱和目标器官的损害，从而引起高血压(hydrophysis）[12]。

柴胡和黄芩越来越多地作为多种心血管疾病中的高血压疾病的补充或替代药物[13,14]。通过数据库的收集，共筛选到柴胡和黄芩53个有效成分和238个预测靶点，高血压相关基因靶点共4103个，对预测靶点与心律失常疾病靶点进行对比分析，得到150个共同靶点。通过构建药物-有效成分-通路-靶点网络图，Degree值排名前三的是槲皮素（quercetin）、豆甾醇（Stigmasterol）、山萘酚（kaempferol），这三种化合物可能为柴胡-黄芩治疗高血压的关键化合物。有研究表明，槲皮素能促进内皮细胞自噬，起到保护血管内皮和降低血压的作用，为高血压的治疗提供了新的靶点[15]，槲皮素还可以下调TLR4/NF-κB信号通路来降低血压值，槲皮素也可以激活AMP激活的蛋白激酶肌球蛋白轻链激酶和磷酸化肌球蛋白轻链调节血管平滑肌细胞的收缩，从而起到降压的作用，而且槲皮素在血压调控方面主要以降低收缩压为主，对舒张压影响不大，充分体现了槲皮素在血压方面的调控优势[16]。豆甾醇，广泛存在于多种植物中，属于植物甾醇的一种，特别是具有能减少心血管疾病的发病风险的作用[17]。

通过构建蛋白相互作用网络，利用软件network-analyzer功能对靶点进行Degree值排序，通过Degree值的大小筛选出Degree值最高的核心靶点，分别为苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）、肿瘤蛋白p53（TP53）、白细胞介素-6（IL6）、肿瘤坏死因子（TNF）、血管内皮生长因子A（VEGFA）。

通过GO富集分析以及KEGG通路富集分析，柴胡-黄芩治疗高血压涉及到通路有PI3K-Akt信号通路、JAK-STAT信号通路、Wnt信号通路、AMPK信号通路、Hippo信号通路。对于高血压疾病来说，心脏是受损的靶器官，而PI3K/AKT信号通路介导在控制心肌细胞病变和保护心脏功能方面作用突出，PI3K/AKT介导通路还可以通过抗氧化作用，保护动物的心肌细胞来维持心脏的正常功能，达到降压作用[18]。二是血管紧张素受体AT1能激活STAT家族中STAT1α/β、STAT2、STAT3磷酸化的JAK通路，启动核转录因子的表达，对血管和心肌细胞的增生、重建和修复进行调节，此外，JAK/STAT通道参与了高血压心肌肥厚过程中的心肌肥大，并导致心室再造，因此抑制JAK/STAT通道对心血管可以起到保护作用[19]。WNT信号通路中WNT5A增高，血压明显升高，其作用机理或与参与脂肪代谢的WNT5A有关[20]。AMPK是一种生物能量代谢调节的关键因子，能被多种刺激激活，如能影响细胞代谢的细胞压力、激素和物质等，而AMPK的激活对高血压有保护作用[21]。GPCRs作为Hippo信号传导的上游调节因子，通过LATS及其底物YAP激活或失活Hippo通路，如AngⅡ型高亲和力结合AT1R后，可通过降低LATS激酶活性而使Hippo通路失活，从而影响肾素-血管紧张素-醛固酮系统，对血压起到调节作用[22]。

综上所述，本研究利用网络药理学方法探究了柴胡-黄芩治疗高血压的活性成分、作用靶点及作用通路，柴胡和黄芩中含有槲皮素（quercetin）、豆甾醇（Stigmasterol）、山萘酚（kaempferol）、汉黄芩素（wogonin）、黄芩素（baicalein）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、异鼠李素（isorhamnetin）、金合欢素（acacetin）等成分，这些活性成分可能作用于PI3K-Akt信号通路、JAKSTAT信号通路、Wnt信号通路、AMPK信号通路、Hippo信号通路来发挥抗高血压的作用。本文采用网络药理学方法探索柴胡-黄芩药对治疗高血压作用机制的预测结果，可为后续柴胡-黄芩药对治疗高血压的实验研究提供方向、理论依据和指导。