超声波辅助酶解山茶籽油提取工艺优化及人工神经网络搭建

包泽伟， 林建原， 张 瑱， 于佩斓， 刘 乐

(浙江万里学院，宁波 315100)

山茶起源于我国云贵高原，国内种植比例占全球95%。山茶树大致分布于亚洲东部及东南部地区[1]，多见于山区丘陵地带。我国对于油茶种植的政策支持力度持续增大，目前种植面积约为6.3×107万亩，高产油茶林高达1.4×107万亩，年产量约为6.3×105t[2-4]。山茶籽油中主要成分为多不饱和脂肪酸与低级饱和脂肪酸，此外还有许多生物活性物质如茶多酚、茶皂素、角鲨烯等，具有一定抗衰老和抗菌作用，被广泛应用于食品、保健品、化妆品以及医药等行业[5,6]。

超声波辅助酶水解山茶籽油提取工艺能在提高其提取率的条件下，免于有机溶剂等污染，降低食用中毒风险，同时还能保存大部分山茶籽中山茶皂苷、茶多酚等活性物质，相比于传统压榨提油工艺具有提取条件温和、无需二次提取、耗能低、废气排放少等优势，其浸出、去杂和精炼工艺步骤更为简单，可大幅度降低对设备的投资[7]，成为新时代环境友好工业发展的必经之路[8]。

研究表明，酶种类的选择对最终游离油得率起决定作用。Fang等[9]采用水酶法提取山茶籽油，通过比较多种酶对提取率的影响发现，使用中性蛋白酶与纤维素酶对油脂的提取率明显高于其他方法，目前此方法的提取率仍受乳化现象等问题的影响。冯红霞等[10]通过超声酶法在0.6 mm物料颗粒、60 ℃酶解温度、3 h酶解时间及2%酶质量分数等条件下，以减少乳状液的方式使游离油提取率达59.2%。本实验采用超声酶解与破乳等步骤减少了水酶法乳化的影响，通过BP神经网络与响应面预测确定与实际更加拟合的方法，使推算最佳工艺更为准确。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

山茶籽，2021年购于浙江省开化县；氢氧化钾、无水乙醇、石油醚、无水硫酸钠：分析纯；甲醇、正庚烷：色谱纯；37种脂肪酸甲酯混合标样，纯度≥99.0%；中性蛋白酶(100 U/mg)。

Eppendorf AG 22331 Hamburg型高速冷冻离心机，TYQ2-IIDN型超声细胞粉碎机，VERTEX70型傅里叶变换红外光谱仪，8890 GC型快速探针杆，7697A型顶空进样器，7693A型自动液体进样器。

1.2 实验方法

1.2.1 超声波辅助酶解提取山茶籽油工艺

1.2.2 山茶籽油单因素实验

对超声功率、超声温度、超声时间、料液比、酶解时间进行单因素实验设计。各单因素四梯度设计：料液比：1∶3～1∶7.5 g/mL；超声时间：5～35 min；超声温度：15～45 ℃；超声功率：50～350 W；酶解时间：1～5.5 h；单因素其他条件分别选择：1∶5 g/mL，25 min，180 W，3 h。并将每项最佳水平设为下一项固定值。设计空白对照实验：料液比1∶4.5 g/mL；酶解时间3 h。

1.2.3 山茶油理化指标测定

总油脂含量测定：GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》[11]。

1.2.4 山茶油成分分析测定

称量样品100 mg于50 mL的比色管中，加入0.125 mol/L KOH-CH3OH溶液5 mL，放置于85 ℃水浴锅中摇晃5 min；加入14% BCl3-CH3OH溶液5 mL,放置于85 ℃水浴锅中不断摇晃5 min；加入正庚烷5 mL，加热3 min，再加入Na2SO45 g，充分振荡。取上清液置于进样小瓶中进行GC-MS分析[12]。GC-MS仪器分析使用1.0 mL/min流速，10∶1分流比，200 ℃进样口温度，EI电离方式，程序升温为100 ℃ 2 min，10 ℃/min至160 ℃；0.4 ℃/min至180 ℃；4 ℃/min至240 ℃保持15 min[13-15]。

1.2.5 响应面设计

根据单因素实验结果并通过Design Expert 12 设计响应面实验表，结果见表1。

表1 响应面实验设计

1.2.6 BP神经网络的建立

BP神经网络是一种模拟大脑进行运算的特殊方式，分为输入层、隐藏层、输出层,每层之间相互关联，但同层各因素之间没有联系[16]。BP神经网络在其基础上增加反向调节功能，即当正向计算时产生的误差大于设定值时反向传递信号，通过修改隐藏层权值以减小误差直到小于设定值的运作方式，该网络具有操作简单、误差小等优点[16]。BP神经网络的建立使用Matlab2021a软件，不同影响因素样本共计17个，其中74%样本用于模型训练，13%样本用于验证训练，13%样本用于测试，神经网络结构搭建如图1所示[17]。

注：X1～X3为输入层3种影响因素；为隐藏神经元；Y为输出值提取率/%；ε为设定误差值。图1 神经网络结构与构建流程图

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

根据表1进行单因素实验设计，空白对照组提取率为11.2%。相较与空白组实验，随着超声时间及超声功率的加大，使得对细胞粉碎强度增大，进而解除了蛋白质、多糖对油脂的包裹，而提取溶剂占比在较时由于无法形成超声对流，提取效果有较大影响，随着占比增提高增加了液体流动性，蛋白酶能更好与底物进行接触，利于提高提取率，但随着溶剂占比继续提高，使酶无法与底物充分接触，导致提取率下降。超声温度对山茶籽油提取率的影响说明温度改变了物料中蛋白质、皂素的结构影响油脂提取率。由于酶解时间的提高，进一步破坏细胞结构，使蛋白质降解为多肽释放更多油脂，则最优条件为：超声时间25 min，超声功率250 W，酶解时间4 h，料液比1∶4.5 g/mL，超声温度35 ℃。

图2 单因素实验结果

2.2 响应面结果分析

在单因素结果的基础上进行响应面实验设计，二次模型方差见表2。

表2 二次模型方差分析

由表2可知，该模型F值为22.47，P值为0.002，表示此模型显著。其中A、C、A2、B2、C2的P值均小于0.01，说明差异极显著。通过响应面软件分析可得到模型。

Y=-216.564+41.501A+0.756B+34.308C+0.007AB-0.094AC-0.031BC-4.592 59A2-0.001B2-3.092C2

该模型最优解为料液比4.68 g/mL，超声功率258.51 W，酶解时间4.19 h，提取率为50.05%。

2.3 BP神经网络结果分析

数据选择为随机选择，以均方误差为性能判定，分别选择3～12个隐藏神经元进行1 000次训练[18]。神经元数量与神经网络准确度密切相关，当神经元数量较低时网络的自由度不足时无法准确计算条件与结果的关系，神经元数量过多会使计算量庞大，耗时更长甚至降低准度。如表3所示，当隐藏神经元数量为5时训练误差最小为0.028(均方误差越低越好，0代表没有误差)。

图3表明，选择3×5×1网络结构回归系数均为0.997。该网络结构具有良好相关性，能准确模拟超声波辅助酶法提取山茶籽油工艺提取率与3种因素之间的关系。

表3 隐藏神经元个数筛选

图3 BP神经网络训练误差图与回归系数

2.4 人工神经网络与响应面比较

响应面及神经网络回归预测结果如图4所示。表4为分别通过响应面设计、BP神经网络进行最佳工艺预测并与实际提取率相比的结果。

响应面能通过图形与函数的直观反映实验快速得出各因素对结果的影响。但是由于本实验中3种因素分别都能对提取率造成较大影响并能二次交互，相较于响应面的多元二次计算，BP神经网络通过多次模拟训练更能实现结果仿真且在最优条件下得出提取率较高，实际值与预测值误差较小。通过其预测最佳工艺，表明该神经网络能有效优化超声辅助酶解法提取山茶籽油工艺。

图4 17组人工神经网络与响应面回归预测

表4 最优条件下响应面与神经网络提取率比较

图5 山茶籽油红外吸收光谱图

2.5 红外吸收光谱对山茶籽油脂肪酸成分分析

山茶籽红外吸收光谱图分析：在3 005.31 cm-1处有强度较弱的吸收谱带，可能为不饱和C—H键的伸缩振动；在1 746.58 cm-1附近有吸收强度较强的吸收谱带，可能为羰键的伸缩振动；在1 164.28 cm-1附近有吸收谱带，可能为醚键的对称伸缩；在2 925.35 cm-1和2 854.42 cm-1附近有2个强度较高的吸收谱带，可能为饱和C—H键的伸缩振动；在1 464.51 cm-1和1 377.51 cm-1，可能存在—CH2—的不对称剪式振动和—CH3的弯曲振动。在722.82 cm-1附近有中强度的吸收谱带，说明存在长链饱和烃(n≥4)[19，20]。

2.6 GC-MS对山茶籽油脂肪酸成分分析

将脂肪酸进行甲酯化，设定色谱、质谱条件进行测定，并通过NISTI7.L数据库进行检索，各组分含量如表5所示。

表5 山茶籽中脂肪酸甲酯化合物含量

3 结论

采用超声波辅助酶解山茶籽油提取工艺，结果表明，可表明超声波与中性蛋白酶的结合作用能起到良好的破碎细胞、降低对油脂的包裹、提高油脂提取率等作用。通过构建响应面与BP神经网络，发现其预测值的标准误差比响应面预测降低0.39%，能更好地反映提取因素对提取率的影响。经GC-MS测定得知山茶籽油脂肪酸主要为油酸89.36%、棕榈酸6.27%、亚油酸2.25%、硬脂酸1.79%、顺式-十八烷酸0.34%，山茶籽油不饱和脂肪酸质量分数达到89.70%，是优质的可食用植物油。