一例猪蓝耳病与副猪嗜血杆菌病混合感染病例的诊断

王泰龙，孟凡亮, ，沈叶盛，赵伊然，李培勋，刘思当*，李宝全*

（1.山东农业大学，山东 泰安 271018；2.华云（山东）检验检疫服务有限公司，山东 泰安）

猪繁殖与呼吸障碍综合征又称猪蓝耳病，是由猪蓝耳病病毒（PRRSV）引起的一种高度接触性传染病，易感猪群具有高发病率及高死亡率，对我国养猪业造成极大的危害[1-2]。虽然目前疫苗免疫能够有效降低猪群的发病率和死亡率，但有研究显示，控制猪蓝耳病的关键是做好种猪群的免疫防控，坚持防大于治的原则[3-5]。

副猪嗜血杆菌病是以呼吸道症状为主的猪细菌性传染病，对不同阶段的生猪发育都会产生不良影响，对膘情较好的保育猪的影响最为严重。副猪嗜血杆菌是养猪场重要的条件致病菌之一，其主要存在于猪上呼吸道，以5～8周龄仔猪最为易感，其中最主要的发病时期是保育阶段[6]。由于副猪嗜血杆菌血清型较多和细菌耐药性的产生，导致目前该病发病率日渐上升。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 2021年11月，泰安市某养殖户猪群突然发病，其中以6周龄的保育猪症状最为严重，主要表现为高热、精神萎靡、呼吸困难等症状。检测样品来自于该群病死猪的组织器官。

1.1.2 主要仪器与试剂 PCR仪，购自Bro-Rad公司；JY600C型电泳仪，购自北京君意东方电泳设备有限公司；SimplyP病毒DNA/RNA 共提取试剂盒，购自杭州博日科技股份有限公司；琼脂糖粉，购自Sigma公司；Easy Script One-step RT-PCR Super Mix，普通Taq酶，DL 2 000 DNA Marker，购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病理剖检及样品采集 对病死猪进行临床剖检，观察组织器官的病变。取猪的肺脏、脾脏、肝脏和淋巴结等组织样品保存以备用。

1.2.2 病料处理与RT-PCR/PCR检测 将采集的组织样品放置于研磨器后加入PBS充分研磨，-20 ℃ 冰箱中反复冻融3次后，9 000 r/min离心3 min，从上清液中提取核酸并将其作为模板进行PCR检测，包括CSFV（猪瘟病毒）、PRRSV（猪蓝耳病病毒）、PRV（猪伪狂犬病毒）、PCV2（猪圆环病毒2型）。对研磨液提取核酸，通过RT-PCR/PCR扩增，PCR产物经1.0 % 琼脂糖凝胶电泳跑胶，凝胶成像仪照相。CSFV、PRRSV、PRV和PCV2抗原片段大小分别为599 bp、1 027 bp、563 bp、785 bp。

1.2.3 细菌分离 无菌条件下使用接种环刺破预先采集好的病猪肝脏，在肝脏内反复旋转几圈后，使用三Z法将接种环涂于含1.5 % NAD和1 % 血清的TSA培养基上，将培养皿放置于37.5 ℃ 恒温培养箱内恒温培养24～36 h。挑取疑似菌落，用HPS特异性引物扩增。HPS抗原片段大小为821 bp。

1.2.4 药敏试验 挑取单菌落接种于含200 μl生理盐水中反复重悬，吸取100 μl接种于普通LB板上，用玻璃棒涂匀，用K-B纸片法进行药敏试验，选取大观霉素、氟苯尼考、恩诺沙星等10种常用抗生素为试验药物，测定抑菌圈直径并参考美国临床和实验室标准协会（CLSI）的标准判断耐药（R）、敏感（S）或中敏（I）进行结果判断与耐药性分析。

1.2.5 组织病理学检查 取肺组织样品于10 %福尔马林溶液固定，常规石蜡切片，HE染色，光镜下观察组织病理学标本。

2 结果与分析

2.1 病理剖检及组织病理学检测

剖检发现在胸、腹腔浆膜及器官表面有大量黄白色纤维蛋白渗出物，呈严重的纤维素性心包炎、胸膜炎及腹膜炎，淋巴结肿大，肺暗红色实变。因大量巨噬细胞及淋巴细胞浸润增生，使肺小叶间质增宽、肺泡壁增厚，部分区域肺泡腔内充满纤维素性渗出物，其中混有嗜中性粒细胞和脱落的肺泡上皮细胞，支气管腔内充满嗜中性粒细胞。根据剖检结果，初步诊断为猪蓝耳病与副猪嗜血杆菌病混合感染。

2.2 RT-PCR/PCR检测

图5 CSFV、PRRSV、PRVgE和PCV2核酸电泳图

结果显示猪蓝耳病病毒为阳性，猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒及圆环病猪均为阴性。

2.3 细菌分离鉴定

结果发现，培养基上长出光滑无色呈针尖大小菌落，符合副猪嗜血杆菌特点。分子生物学检测结果显示肝肺综合征HPS条带为阳性。

2.4 药敏试验

结果显示所分离嗜血杆菌对恩诺沙星、林可霉素及大观霉素敏感，对磷霉素、新霉素、头孢喹肟、粘杆菌素中介，对阿莫西林、氟苯尼考、环丙沙星抗生素耐药。

3 讨论

基于诊断结果采取了以下综合防控措施：将发病猪群进行隔离，进行带猪喷淋消毒，对猪圈清扫消毒；在饲料中添加抗病毒药物（黄芪多糖）及抗生素（林可霉素和泰万菌素）。经治疗最终只死亡了7头猪，疫情得到有效控制。

目前我国控制传染病仍要坚持防大于治的原则，为此笔者协助猪场制定了严格的生物安全措施，通过血清抗体水平检测，评估了各猪群猪蓝耳病免疫水平及感染状态，调整优化了免疫程序[7]。并制定了断奶保育仔猪的药物预防程序：即断奶后1～5 d，阿莫西林饮水或拌料；断奶后11～15 d，氟苯尼考饮水或拌料；断奶后21～25 d，强力霉素饮水或拌料。