腐败梭菌胶体金试纸条检测方法的建立及类毒素疫苗的制备和应用

翁鸿宇，王秀媛，沈志强，宋松林，廉 维，柴同杰，韦良孟

（1.山东农业大学动物科技学院，山东 泰安 271018；2.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州；3.吉林正业生物制品股份有限公司，吉林 吉林）

腐败梭菌是一类可形成芽孢的革兰氏阳性厌氧杆菌，可以产生芽孢，可在许多不同的环境中发现，主要感染人类和动物，该菌产生强大的外毒素，导致迅速和潜在的致命疾病[1]，造成无数人伤亡和每年数十亿美元的农业损失[2]。而在羊快疫诊断方面，存在基层缺乏诊断技术试剂、诊断不及时等问题，以至在动物发病之前无法采取针对性治疗措施；在疾病防制方面，存在疫苗有效抗原成分较低，免疫效果不理想等问题[3]。针对以上问题，本研究探索了更合适、更高效的腐败梭菌增菌和产毒培养基和技术方法，以建立一种能够快速诊断腐败梭菌病的胶体金试纸条，并制备安全有效的腐败梭菌类毒素疫苗，为羊快疫的早期诊断和预防提供理论借鉴和技术储备。以期降低因羊快疫的暴发而造成的经济损失。

1 材料与方法

1.1 材料

腐败梭菌参考株ATCC 12464购自美国菌种保藏中心；脑心浸液培养基（BHI）、厌气肉肝汤培养基采购自青岛海博生物技术有限公司；羊抗兔IgG-HRP、羊抗鼠IgG-HRP采购自杭州华安生物公司；腐败梭菌特异性引物合成自青岛擎科梓熙生物科技有限公司。未免疫的40 kg左右绵羊（腐败梭菌抗体阴性）购自泰安市下旺村羊场；3～4周龄的健康雌性昆明小鼠购自济南朋悦实验动物有限公司；日本大白兔购自武汉市万千佳兴生物科技有限公司；临床样本（1～6号）血清采集于青海牧区羊快疫发病羊群；阴性样本血清采集于泰安市下旺村羊场健康羊群；豚鼠血清为本实验室保存。实验动物的使用和操作按照实验动物福利的相应要求进行。

1.2 方法

1.2.1 腐败梭菌培养条件的摸索 设置3组实验环境，分别设置不同培养基、不同气体环境以及不同培养基pH，放置于培养箱中，37 ℃，震荡培养24 h后取出，将3组各取20 μl进行革兰氏染色镜检，并测量各菌液在波长600 nm下的OD值。

1.2.2 腐败梭菌胶体金试纸条检测方法的建立（1）腐败梭菌多克隆抗体的制备。①总蛋白的获取及鉴定。对腐败梭菌培养物进行菌液PCR扩增和凝胶电泳鉴定。于剩余菌液中加入0.4 % 的甲醛，在37℃温箱中震荡48 h，取出后8 000 rpm离心20 min，弃去上清，将沉淀用100 ml PBS充分旋起，重复离心，去除外毒素成分，获得灭活后的抗原，进行SDS-PAGE鉴定，观察到目的条带。②多克隆抗体免疫兔。取2只健康日本大耳白兔子，取500 mg抗原与弗氏完全佐剂混合后进行皮下注射，免疫2～3周，二免三免时取300 mg抗原与弗氏不完全佐剂混合，对一免兔子进行皮下注射反应2周，四免时反应时间缩短为1周，其余处理不做改变。③纯化后抗体效价检测。取四免后的血清，将抗体进行亲和层析纯化，将纯化后的抗体进行SDS-PAGE质控分析，测定抗体浓度，并通过间接ELISA检测纯化后抗体效价。（2）腐败梭菌胶体金试纸条的制备。①胶体金溶液最适pH与最佳标记量的确定。首先用胶体金梯度法确定抗体与胶体金结合的最适pH，再使用纯化水将腐败梭菌抗体稀释成1 mg/ml，把稀释液各取0、5、10、20、30、40、60、80 μl，按顺序加入8个1 ml装有最适pH胶体金溶液的小试管中混匀，室温静置1～2 h，观察结果，确定最佳标记量。②胶体金-抗体结合物的制备。将最适pH胶体金溶液20 ml加入腐败梭菌抗体中，在室温下搅拌30 min后，加入10 % BSA 2 ml或者10 % 聚乙二醇（MW 20 000）0.2 ml于其中，室温搅拌10 min，9 000～11 000 rpm离心40～60 min，弃去上清，沉淀溶于2 ml胶体金－抗体保存液中，过滤得胶体金－抗体结合物原液。使用梯度稀释法确定结合物原液工作浓度。③金标垫的制备及点膜。根据模具制备金标垫。最后，建立检测线（T线）及质控线（C线）后，用划膜机在NC膜上点膜。

1.2.3 腐败梭菌胶体金试纸条的检测试验（1）灵敏性检测。随机抽取4支胶体金试纸条，分别向加样孔中滴加约100 μl的PBS、阴性样本稀释液、阳性样本2倍和6倍稀释液，室温下反应10 min。观察结果反应是否灵敏。（2）特异性检测。分别取实验室保存的感染腐败梭菌豚鼠血清，感染诺维氏梭菌豚鼠血清和健康豚鼠血清分别进行PCR鉴定。取各血清100 μl，滴加至胶体金试纸条点样孔，室温下反应10 min，观察对腐败梭菌的鉴定的特异性。（3）重复性检测。用不同批次试纸条重复上述试验，观察结果是否存在差异。

1.2.4 腐败梭菌类毒素疫苗的制备 （1）腐败梭菌外毒素的获取及小鼠最小致死量（MLD）的测定。将本实验室制备的腐败梭菌菌液，8 000 rpm离心20 min，弃去沉淀，将上清过滤除菌，加入等体积的饱和硫酸铵溶液，4 ℃静置过夜，取出产物使用8 000 rpm离心20 min，弃去上清，沉淀溶解于100 ml Tris-Hcl中。通过SDS-PAGE进行验证。取5组健康昆明小鼠，每只腹腔注射0.5 ml使用生理盐水倍比稀释的腐败梭菌外毒素。观察小鼠在48h内的死亡情况，使组内全部小鼠死亡的最大稀释倍数为腐败梭菌外毒素的小鼠最小致死量（《中华人民共和国兽药典》第3版）。（2）外毒素的灭活及检验。将粗提的外毒素平均分为3份，分别加入不同体积甲醛，37 ℃ 摇床震荡灭活。过程中，每隔24 h腹腔注射3只小鼠，1 ml/只，3只小鼠均不死亡即灭活完全。（3）白油佐剂类毒素疫苗的制备及检验。疫苗水相：在已经灭活完全的类毒素溶液中按照5 %的比例加入tween-20震荡混匀；油相：将Span-80和白油以94:6的体积比进行混合，再在Span-80和白油的混合溶液中加入硬脂酸铝使硬脂酸铝的终浓度为2 %，摇晃混匀，放于121 ℃ 高压灭菌锅中灭菌15 min。水相与油相以1:1.5的比例在组织切割机内进行充分乳化。按《中华人民共和国生物制品规程》检验合格，放置于4 ℃ 保存。

1.2.5 腐败梭菌类毒素疫苗免疫保护性试验（1）类毒素疫苗免疫小鼠攻毒试验。准备3组9只3～4周龄的健康昆明小鼠，A组、B组内小鼠分别腿部肌肉注射0.1 ml、0.2 ml腐败梭菌类毒素疫苗，C组分别不做处理。21 d后，9只小鼠均腹腔注射1MLD腐败梭菌外毒素。观察记录48 h内，小鼠的死亡情况。（2）类毒素疫苗免疫小鼠的抗体水平检测。准备3组共18只3～4周龄的健康昆明小鼠，平均分组。A组、B组分别腿部肌肉注射0.1 ml、0.2 ml腐败梭菌类毒素疫苗，C组不做处理。在免疫后的21 d和28 d，每组选取3只进行眼球采血，离心取血清。以腐败梭菌外毒素为包被抗原，用间接ELISA的方法测定小鼠血清抗体水平。（3）小鼠中和试验检测绵羊血清抗体。取上述试验中的B组第3周血清，2倍腐败梭菌外毒素对小鼠的最小致死量（MLD）与0.2 ml，1:200，1:400，1:600，1:800倍稀释的绵羊血清混合，用生理盐水定容到1 ml，放于37 ℃ 温箱孵育2 h，每个稀释倍数腹腔注射5只小鼠各0.5 ml，观察小鼠存活情况。记录0.1 ml血清可中和的腐败梭菌外毒素对小鼠的最小致死量。

2 结果与分析

2.1 腐败梭菌培养条件摸索

设置3组实验环境，分别设置不同培养基、不同气体环境以及不同培养基pH，放置于培养箱中，37 ℃，震荡培养24 h后取出，每管各取20 μl进行革兰氏染色镜检，并测量各菌液在波长600 nm下的OD值。

如下图所示，置于自制培养基培养、一定气体比例、pH=7.8的培养环境中培养的腐败梭菌菌液在波长600 nm下的OD值更大，培养效果更好。

图1 腐败梭菌在不同培养环境中的增菌情况

图2 腐败梭菌在不同pH中的增菌情况

2.2 腐败梭菌胶体金试纸条的制备

2.2.1 腐败梭菌菌体蛋白的获取 （1）腐败梭菌菌液PCR鉴定。将腐败梭菌进行增菌培养，取少量菌液进行PCR扩增和凝胶电泳鉴定，结果如图3所示，显示出单一的大小为527 bp的目的条带。

图3 腐败梭菌PCR扩增和凝胶电泳鉴定

（2）腐败梭菌菌体蛋白检测。将菌液浓缩，除去对于培养基和外毒素成分，将菌体超声破碎并完全灭活。通过SDS-PAGE质控分析，结果如图4所示：可以看到清晰的蛋白条带，蛋白含量较高。

图4 菌体蛋白SDS-PAGE分析

2.2.2 高免血清中抗体效价的检测 取兔四免抗血清，进行抗体效价检测，结果显示所得到的抗血清中腐败梭菌抗体效价为1:102 4000，可用于胶体金试纸条的制备。

2.2.3 纯化后抗体检测 将纯化后的抗体进行SDS-PAGE质控，结果如下图所示，纯化后抗体浓度为10 mg/mL；并通过间接ELISA检测纯化后抗体效价，结果显示所制备的多克隆抗体灵敏度良好。

图5 多克隆抗体纯化SDS-PAGE分析

2.2.4 抗体标记最适pH与最佳标记量的选择用胶体金梯度法确定抗体与胶体金结合的最适pH。当pH小于8.0时，胶体金溶液会随着反应的进行无法保持红色，而pH为8.0时，胶体金溶液保持红色。由此可确定腐败梭菌抗体与胶体金结合的最适pH为8.0。

采用蛋白梯度法确定腐败梭菌抗体与胶体金结合的最适浓度。对照组和5 μg组呈现由红变蓝的聚沉现象，而从抗体大于10 μg组时管中保持红色不变。由此可知10 μg为胶体金液由红变蓝的交界管。因此，腐败梭菌抗体稳定1 ml胶体金所需的最适抗体量为10 μg/ml。

图6 胶体金标记最适pH

图7 抗体最适标记量

2.2.5 确定结合物原液工作浓度的和制备金标垫用工作液将胶体金－抗体结合物原液按1:2、1:4、1:8、1:16进行稀释，取1.4 ml胶体金－抗体结合物稀释液，均匀地加在玻璃纤维膜上，置37 ℃烤干，即为金标垫，测试后确定胶体金标记抗体的最适工作浓度。

2.2.6 胶体金探针的制备和纯化 在1 ml胶体金－抗体结合物溶液中加入10 % NaCl水溶液1 ml后，溶液仍为无沉淀的紫红色液体，说明制得的胶体金－抗体结合物原液具有良好的稳定性。

2.2.7 检测线（T线）及质控线（C线）条件的建立和优化 对NC膜上T线及C线的包被抗体设置几个浓度梯度进行试验。结果表明，检测显色效果最优的一组浓度：腐败梭菌抗体（T线上）工作浓度为1.5 mg/ml，羊抗兔IgG抗体（C线上）工作浓度为1 mg/ml。

2.2.8 腐败梭菌胶体金试纸条的检测结果 对本研究所制备的腐败梭菌胶体金试纸条进行灵敏性检测、特异性检测、重复性检测，结果显示为明显的阳性反应，而这与血清PCR反应结果相一致。由此说明，此胶体金试纸条灵敏性、特异性良好。

图8 腐败梭菌外毒素的SDS-PAGE鉴定

2.3 腐败梭菌类毒素疫苗的制备

2.3.1 腐败梭菌外毒素的鉴定 将腐败梭菌进行增菌及产毒培养后，过滤除菌，用饱和硫酸铵进行粗提，静置过夜后，沉淀溶解于Tris-Hcl中。即得到腐败梭菌外毒素，通过SDS-PAGE分析，可看到46kDa处有明显的蛋白条带，且与腐败梭菌α毒素条带大小相吻合。

2.3.2 小鼠致死量（MLD）的测定 取已粗提纯的腐败梭菌外毒素，将50倍、100倍、200倍和400倍稀释液和生理盐水分别腹腔注射5组健康昆明小鼠，每组5只各0.5 ml。使本组内小鼠全部死亡的最大稀释倍数为此外毒素对于小鼠的最小致死量（《中华人民共和国兽药典》第3版）。结果如表2，腐败梭菌粗提外毒素的最小致死量为5 μl。

表2 外毒素小鼠最小致死量测定结果

2.3.3 外毒素的灭活和检验 将粗提的外毒素平均分为3份，分别加入甲醛，使其终浓度为0.3 %、0.4 %、0.5 %，置于37 ℃ 摇床中震荡灭活，每隔24 h腹腔注射3只小鼠，1 ml/只。如表3所示，甲醛最佳灭活浓度为0.4 %，最佳灭活时间为72 h。

表3 不同浓度甲醛灭活时间

2.3.4 腐败梭菌类毒素疫苗的安全检验 制备的腐败梭菌类毒素疫苗无菌检验，甲醛、硫柳汞残留量检验，均符合《中华人民共和国兽用生物制品》要求。安全性检验中，家兔无异常情况，无肉芽或溃疡产生。

2.3.5 疫苗免疫效果的初步检测 （1）类毒素疫苗免疫小鼠攻毒试验。将9只3-4周龄的健康昆明小鼠，分为3组，A组、B组分别腿部肌肉注射0.1 ml、0.2 ml腐败梭菌类毒素疫苗，C组分别不做处理。正常饲喂21 d后，9只小鼠均腹腔注射1MLD腐败梭菌毒素，观察记录死亡情况。结果如表4所示，C组小鼠全部死亡说明，腐败梭菌类毒素疫苗对试验小鼠起到的一定的免疫保护作用。

表4 不同接种剂量下小鼠攻毒试验结果

（2）类毒素疫苗免疫小鼠的抗体水平检测。用间接ELISA方法检测抗体水平，并取平均值。结果如表5所示，在免疫后的21 d，2个接种剂量下的小鼠抗体效价均为1:6 400；而免疫后的28 d，免疫0.2 ml组的小鼠血清抗体效价下降。

表5 不同免疫剂量下的小鼠抗体水平

2.3.6 小鼠中和试验检测抗体 取上述试验中的绵羊3.5 ml组第3周血清，2倍腐败梭菌外毒素对小鼠的最小致死量（MLD）与0.2 ml，1:200，1:400，1:600，1:800倍稀释的绵羊血清混合，用生理盐水定容到1 ml，放于37 ℃ 温箱孵育2 h，每个稀释倍数腹腔注射注射小鼠5只各0.5 ml，观察小鼠存活情况。小鼠全部存活的血清最大稀释倍数即为0.1 ml血清可中和多少小鼠的最小致死量。结果如表6所示，当血清稀释比为1:600时，小鼠全部存活；稀释比为1:800时3只小鼠死亡。因此0.1 ml血清能中和600个小鼠最小致死量的毒素。

表6 绵羊血清抗体小鼠中和试验结果

3 讨论与结论

羊快疫由腐败梭菌引起，发病急、致死快且临床症状不典型。目前，我国通常接种梭菌联苗进行预防，出现典型症状时采用耗时较长的传统的诊断方法往进行检测，导致羊群不能得到及时治疗大面积感染。基于以上原因，本研究首次成功建立了腐败梭菌胶体金快速诊断方法。本研究通过将腐败梭菌菌体蛋白质控分析发现其成分较为单一，可用于多克隆抗体的制备。由于腐败梭菌为革兰氏阳性菌，细胞壁多层较厚，且在体液免疫过程中菌体会在酶的作用下裂解，本研究中参考了鞠文等人方法进行菌体蛋白处理[4]，并利用改进的腐败梭菌培养方法制备了有效抗原成分较高的腐败梭菌类疫苗。能够针对性的预防羊快疫，高效、便捷的及时做出疾病诊断，填补我国现有腐败梭菌病诊断技术的空白。

本研究成功制备了高效腐败梭菌抗血清，抗体效价达到1:1024000，经纯化获得腐败梭菌多克隆抗体，抗体最适标记量为10 μg/ml，从而建立腐败梭菌胶体金快速检测方法。经检测，此方法特异性强，灵敏度高，临床诊断符合预期效果。首次创新性地制备了腐败梭菌外毒素，并制备腐败梭菌白油佐剂类毒素疫苗。此疫苗免疫小鼠21 d后，血清中抗体效价达到1:6 400。免疫绵羊第21 d抗体水平达到最高，并持续到第6周。确定参考免疫剂量为3.5 ml，且免疫21 d后，血清小鼠中和效价为1:600。初步说明此疫苗免疫效果良好，具备良好的临床应用前景。

本研究建立的腐败梭菌胶体金层析技术用于疾病诊断具有高效、便捷、灵敏度高等优点，将此技术应用于腐败梭菌病的诊断，可填补我国现有腐败梭菌病诊断技术的空白。同时，在我国牧区，羊只接种梭菌联苗后发生羊快疫的事件屡有报道，目前市面上所销售的针对于羊快疫的疫苗多为梭菌三联或四联灭活疫苗，在疫苗的制备过程中基本使用菌液作为免疫原，彭小兵等人的研究发现其检验合格率较低，且其研究表明毒素的含量是影响免疫效果的重要原因，因此，本研究所制备的腐败梭菌类毒素疫苗对于防治羊快疫至关重要。