HAp增强PLA纤维基人工韧带的骨细胞活性研究

陆 腱，李 宏，刘桂连，吴琪琳，华英汇，费 翔*，朱美芳

(1.东华大学 材料科学与工程学院 纤维材料改性国家重点实验室，上海 201600；2.复旦大学附属华山医院运动医学科，上海 200040)

人工韧带是韧带重建手术中重要的医疗器械，其市售产品主要由聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)纤维编织制成。PET不可生物降解的特性使得PET人工韧带在植入后会因材料蠕变、与天然组织应力传递方式不匹配等原因失效[1-3]，需二次手术取出。因此，开发可生物降解纤维组成的人工韧带成为韧带修复器械研究的热点。

通过熔融纺丝法制备的聚乳酸(PLA)纤维拉伸强度接近PET纤维，同时可生物降解，有望取代PET纤维成为人工韧带的基体。从1996年开始，研究者们开始采用PLA纤维制备人工韧带，并用于动物韧带功能的重建[2, 4-8]。上述工作多通过编织结构调节人工韧带力学性能和拓扑结构，在纤维材料的功能化方面有待深入研究。作者拟在PLA纤维的熔纺制备过程中，借助熔融加工技术杂化引入广泛用于促进骨组织修复的活性物质羟基磷灰石(HAp)[9-12]，以增强PLA纤维基人工韧带与骨细胞的相容性。首先借助熔融共混将纳米级的HAp分散于PLA，制成与PLA切片尺寸相近的毫米级杂化树脂；然后将杂化树脂与PLA切片复配进行熔融纺丝，制成含有HAp的PLA杂化纤维；最后通过编织技术将杂化纤维集成为人工韧带材料；从形貌、结构、力学性能、细胞相容性方面研究了HAp的引入对PLA-HAp杂化纤维、人工韧带的影响。

1 实验

1.1 主要原料与试剂

PLA：牌号FY601，安徽丰原集团有限公司产；HAp：针状，南京埃普瑞纳米材料有限公司产；去离子水、无水乙醇：上海泰坦科技股份有限公司产；PBS缓冲液、胰酶细胞消化液、Calcein-AM试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司产；CCK8细胞计数试剂盒：日本Dojindo研究所产；αMEM完全培养基、小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3)：上海中乔新舟生物科技有限公司产。

1.2 主要设备及仪器

CTE 20-48双螺杆共混挤出机：南京科倍隆机械有限公司制；纳米杂化纤维熔纺成形试验专用设备：上海金纬化纤机械制造有限公司制；YG086缕纱测长仪：常州市中纤检测仪器设备有限公司制；DZF-2018B捻绳机：东莞德至丰科技有限公司制；DT-01表面等离子处理仪：苏州市奥普斯等离子体科技有限公司制；Ni-U光学显微镜：日本尼康公司制；Hitachi SU8010扫描电子显微镜：日本日立公司制；Prodigy-ICP等离子体光谱仪：美国利曼公司制；204F1差示扫描量热仪：德国耐驰公司制；D/max-2550VB+/PC型X射线衍射仪：日本理学公司制；YG029全自动单纱强力机：常州市中纤检测仪器设备有限公司制；INSTRON 5969电子万能材料试验机：美国英斯特朗公司制；荧光显微镜：德国Leica公司制。

1.3 PLA-HAp纤维及其人工韧带的制备

1.3.1 PLA-HAp杂化树脂的制备

将HAp置于真空烘箱中，于100 ℃下干燥12 h；对于PLA切片，先将切片置于真空转鼓烘箱中在80 ℃下真空干燥4 h以除去水分，再于100 ℃真空干燥4 h对PLA进行预结晶。按一定质量比机械混合干燥后的HAp与PLA切片，借助双螺杆共混挤出机进行熔融共混、挤出、造粒，制备HAp质量分数为10%的PLA-HAp杂化树脂。其中，熔融共混工艺如下：双螺杆共混挤出机一区30 ℃、二区180 ℃、三区190 ℃、四区至机头210 ℃，螺杆转速为300 r/min。

1.3.2 PLA-HAp杂化纤维的制备

首先按一定质量比机械混合PLA-HAp杂化树脂与PLA切片，并采用1.3.1中干燥PLA切片的方法进行干燥；然后进行熔融纺丝，采用36孔常规圆形喷丝板制备PLA-HAp初生纤维；再通过自主设计的拉伸设备将初生纤维在60 ℃下进行2倍拉伸，然后在100 ℃下热定型，得到线密度约60 dtex的PLA-HAp杂化纤维。其中，PLA-HAp杂化树脂质量分数为0、5%、10%、15%(即HAp质量分数分别0、0.5%、1.0%、1.5%)的PLA-HAp纤维试样分别标记为PLA-HAp0、PLA-HAp0.5、PLA-HAp1.0、PLA-HAp1.5。

1.3.3 PLA-HAp纤维基人工韧带的制备

PLA-HAp纤维基人工韧带的制备参考蚕丝基人工韧带的编织方法[13-15]。采用缕纱测长仪量取12束长为1 m的PLA-HAp纤维并将其捋成一股，采用捻绳机以100 圈/min的转速，先对纤维束顺时针加捻69 s，再在伸直状态下对折纤维束并逆时针加捻33 s，然后如上对折并顺时针加捻10～11 s，最后对其末端进行打结，编织得到PLA-HAp纤维基人工韧带材料。

将该材料置于100 ℃真空烘箱中处理1 h以消除编织过程中产生的内应力；再将材料浸泡于体积分数75%的乙醇水溶液中以除去纤维中的纺丝油剂；然后将材料在室温下真空干燥，采用表面等离子处理仪在200 W下处理10 min，以提高材料表面亲水性。

1.4 分析与测试

微观形貌：采用扫描电子显微镜(SEM)观察杂化树脂、纤维截面的微观形貌，其中杂化树脂的放大倍数为10 000，纤维截面的放大倍数为20 000。

元素组成：借助强酸溶解纤维，采用等离子体光谱仪(ICP-OES)测试PLA-HAp杂化纤维中无机元素钙(Ca)、磷(P)的含量。

结晶结构：采用差示扫描量热仪对PLA-HAp杂化纤维进行测试。从40 ℃开始，以10 ℃/min的速率升温至200 ℃。对于获得的差示扫描量热(DSC)升温曲线，先分别对160～180 ℃的结晶熔融峰和110 ℃附近的冷结晶峰积分，计算试样的结晶熔融焓(∆Hf)与冷结晶焓(∆Hc)，按照式(1)计算试样的结晶度(Xc)。

Xc=(∆Hf-∆Hc)/93.0 ×100%

(1)

取向结构：将多束纤维制成单丝平行排列、长度为10 cm以上的试样，固定于X射线衍射仪靶台进行测试，对获得的X射线衍射(XRD)曲线进行积分分析，计算半高宽之和(HFWHM)，然后通过式(2)计算试样的结晶择优取向度。

f=(360-HFWHM)/360 ×100%

(2)

式中：f为取向因子，f为100%时说明材料各向异性，f为0时说明材料各向同性。

力学性能：采用全自动单纱强力机对PLA-HAp纤维进行测试，夹持距离为500 mm，拉伸速度为500 mm/min；采用电子万能材料试验机对PLA-HAp纤维基人工韧带进行测试，夹持距离为30 mm，拉伸速度为15 mm/min。

骨细胞活性：将MC3T3细胞种植于装有灭菌人工韧带材料的24孔培养板，培养基用量为0.5 mL/孔，细胞种植密度为5×104个/孔；然后分别在培养1，3，5 d后将人工韧带材料取出置于空白24孔板，借助CCK8试剂盒对材料上存活细胞数量进行测试，试样中活细胞数量采用酶标仪测得的活细胞指示物强度(OD值)来表征，所有试样均平行重复测试不少于3次。

骨细胞形态：采用钙黄绿素(Calcein-AM)试剂盒对人工韧带材料上的骨细胞进行活细胞染色，细胞形态通过荧光显微镜观测骨细胞在人工韧带材料的存活情况。

细胞实验数据的统计学分析：使用Origin 8.5软件中的单因素方差分析进行试验数据的显著性差异分析，选择0.05作为显著性水平值。显著性差异水平(p)标记如下：p小于0.05为*，p小于0.01为**，p小于0.001为***。

2 结果与讨论

2.1 PLA-HAp杂化树脂及纤维的微观形貌

从图1a中可发现，PLA-HAp杂化树脂有明显区别于周边基体的白色颗粒，这些颗粒与HAp纳米粒子尺寸相近，可推断为分散于PLA中的HAp纳米粒子，且HAp在树脂中分布较均匀，将该杂化树脂用于熔融纺丝可实现HAp均匀分散于纤维中，但与PLA基体边界较清晰，即两者相容性不是很好，可能会影响纤维的加工和性能。从图1b和图1c可看出：相对于PLA-HAp0的截面，PLA-HAp1.0的截面中可以观测到纳米级的粒子聚集体，这证实了纳米HAp在PLA纤维中的有效负载；同时，PLA-HAp纤维中的纳米聚集体结构与周围的PLA存在明显的边界，可能会成为纤维受力时的应力集中点，导致纤维更易破坏。

图1 PLA-HAp树脂及纤维的微观形貌

2.2 PLA-HAp杂化材料的熔融纺丝工艺

将PLA-HAp杂化树脂与PLA切片按一定比例混合，再进行熔融纺丝，以制备杂化纤维及梯度调控纤维中HAp含量。从表1可知，在熔融纺丝过程中，PLA-HAp1.5的纺丝成形温度高于HAp含量更低的其他试样，这是因为随着PLA-HAp体系中与PLA相容性差的HAp含量增大，体系流变性能会变差，需提升温度改善熔体流动速率以满足成纤加工需求。

表1 PLA-HAp纤维的熔融纺丝工艺参数

2.3 HAp含量对PLA-HAp纤维结构与性能的影响

相对于PLA，HAp含有Ca、P两种元素，采用ICP-OES测试纤维中的Ca、P元素含量以表征HAp负载量。从表2可知：随着HAp添加量增加，杂化纤维中Ca、P元素含量梯度上升，与预期一致；纤维断裂强度都大于3 cN/dtex，满足编织加工的需求；随着HAp的加入，纤维的断裂强度由3.87 cN/dtex降低至3.16 cN/dtex，断裂伸长率也由28.2%降低至25.9%，这归因于HAp与PLA的相容性较差，在受力时易使纤维内部形成缺陷导致断裂。

表2 PLA-HAp纤维的结构与性能

对于聚合物纤维材料，聚集态结构对其力学性能有着重要的影响。从各纤维试样的DSC曲线(图2a)可以看出，在110 ℃附近均无结晶峰，在160～180 ℃均有结晶熔融峰，说明纤维经拉伸后均已结晶完善。从表2也可知，纤维的Xc随着加入HAp含量的增加而增大，这是因为PLA是半结晶聚合物，HAp的纳米尺度结构可以诱导PLA异相成核，加速结晶，Xc由47.1%提升至49.1%及以上。对于纤维的取向结构，从图2b和表2可知，随着PLA-HAp纤维中HAp含量升高，纤维的f先增大后减小，这是因为HAp呈针状，其作为PLA的成核剂利于PLA沿取向方向结晶，因此纤维引入HAp后，晶区f由93.1%提升至96.1%；但HAp含量过多时，会阻碍晶区的取向运动，因此PLA-HAp纤维的f会随HAp含量的增加而降低，从96.1%降低至93.7%。

图2 PLA-HAp纤维试样的DSC曲线和XRD曲线

2.4 PLA-HAp纤维基人工韧带的形貌与力学性能

通过SEM分析PLA-HAp纤维基人工韧带的微观形貌，如图3所示，由于各纤维试样的线密度相近、截面形状相同，PLA-HAp纤维基人工韧带在径向尺寸上差异较小，直径均为1 mm左右。

图3 PLA-HAp纤维基人工韧带的SEM照片

从表3可知：各PLA-HAp纤维试样所制人工韧带的拉伸强度都在87 MPa以上，约为人体前交叉韧带(38.70 MPa[16])的2.2倍，可用于重建前交叉韧带功能；负载有HAp的PLA-HAp纤维基人工韧带在直径上较细；含有HAp的PLA-HAp纤维基人工韧带具有较低的最大载荷和断裂伸长率；由于直径上的差异，在拉伸强度方面，含HAp的PLA-HAp纤维基人工韧带与纯PLA纤维基人工韧带差异较小。

表3 PLA-HAp纤维基人工韧带的直径和力学性能

2.5 PLA-HAp纤维基人工韧带的骨细胞活性

采用MC3T3骨细胞来研究PLA-HAp纤维基人工韧带对骨细胞性能的影响。从图4可知，种植在人工韧带上的MC3T3细胞，其细胞活性随共培养时间的延长而增大。其中，共培养1 d后各组韧带上的活细胞数量无明显差异；此后，含HAp的纤维基人工韧带上的细胞活性开始明显高于无HAp的PLA-HAp0人工韧带，尤其是HAp负载量最高的PLA-HAp1.5人工韧带，其在培养3，5 d后与PLA-HAp组都表现出显著性差异(3 d后p小于0.001，5 d后p小于0.01)。上述CCK8测试结果表明了HAp的引入可有效改善PLA纤维基人工韧带与MC3T3细胞的相容性。

图4 PLA-HAp纤维基人工韧带与骨细胞相容性的CCK8表征

基于上述分析，以无HAp的PLA-HAp0人工韧带和HAp负载量最高的PLA-HAp1.5人工韧带为研究对象，研究HAp的负载对人工韧带骨细胞活性的影响。借助Calcein-AM对韧带上存活的骨细胞进行染色，并通过荧光显微镜进行观测。从图5可以看出：在共培养1 d后，PLA-HAp0和PLA-HAp1.5两组人工韧带上都黏附着少量Calcein-AM标记的活细胞(图5a和图5d)；随着共培养时间的延长，被标记活细胞的数量开始增多，且PLA-HAp1.5人工韧带上细胞数量多于PLA-HAp0人工韧带上细胞数量(图5 b和图5e, 图5c和图5f)，这与上述CCK8测试的结果相一致。

图5 PLA-HAp纤维基人工韧带上骨细胞的Calcein-AM染色图示意

从图6可以看出：人工韧带上细胞外基质和黏附细胞随共培养时间而增加；培养1 d后，细胞黏附于人工韧带的组成纤维上，同时大部分纤维还可看出原有轮廓(图6a和图6d所示)；培养3 d后，随着细胞在人工韧带上的增殖、迁移，人工韧带上部分纤维的轮廓随黏附细胞及细胞外基质发生改变，其中PLA-HAp1.5人工韧带上纤维开始被细胞和细胞外基质黏结(图6b和图6e所示)；培养5 d后，在PLA-HAp1.5人工韧带中，开始有部分纤维上黏附的细胞发生汇聚，形成2～4倍纤维直径的聚集体(图6c和图6f所示)。因此，上述SEM图像表明了MC3T3细胞在PLA-HAp1.5人工韧带上的生长速度快于PLA-HAp0人工韧带，进一步验证了人工韧带中HAp的加入对MC3T3细胞增殖行为的促进作用；同时细胞外基质的发展和细胞的生长都是沿着纤维方向进行的，而人工韧带中的纤维主要是沿韧带轴向方向排布的，因此该纤维组成的人工韧带拓扑结构可诱导细胞沿韧带轴向取向生长，利于重构结构上沿韧带轴向取向的韧带组织。

图6 PLA-HAp纤维基人工韧带上骨细胞的SEM照片

综上所述，HAp的负载有效提高了PLA纤维基人工韧带的骨细胞活性，有利于骨细胞在材料表面的增殖，可加速人工韧带与周围骨组织的整合。

3 结论

a.通过熔融共混技术将纳米HAp均匀分散于PLA树脂中，再与尺寸相近的PLA切片复配混合，经熔融纺丝获得断裂强度高达3.16～3.27 cN/dtex的PLA-HAp杂化纤维。在聚集态结构方面，HAp的加入可提高PLA纤维的结晶度和取向度，但其与PLA相容性较差，使得纤维在受力条件下易因结构缺陷导致断裂，以致整体的断裂强度和断裂伸长率稍低。

b.将PLA-HAp杂化纤维编织成人工韧带，PLA-HAp纤维基人工韧带的拉伸强度达87.1～94.2 MPa，满足重建韧带功能的需求。

c.在生物功能方面，HAp的加入可有效在人工韧带表面引入Ca、P元素，从而显著提升人工韧带与骨细胞(MC3T3)的相容性，证实了通过负载HAp提高PLA纤维基人工韧带骨细胞活性的有效性。