桑叶叶际和家蚕肠道细菌群落结构及功能分析

刘桂伽，陈永静，孙庆业，张明珠

(安徽大学资源与环境工程学院，安徽省矿山生态修复工程实验室，合肥 230601)

家蚕（Bombyx moriL.）是鳞翅目昆虫，其幼虫以桑叶为主要食物，在我国的丝绸生产方面发挥着重要的经济价值[1-2]。家蚕因其体积较小、喂养周期短、易于饲养等优点，是生物学、害虫防治和免疫学等研究中重要的模式昆虫之一[3]。家蚕的蚕丝产量等与其生长发育密切相关，人们对其生长发育的研究主要集中在食物种类、组成成分以及家蚕消化道环境方面[4]。

植物叶片外表面为细菌、真菌（丝状和酵母）、藻类等微生物的定殖提供场所（叶际phyllosphere）[5]，这些生活在叶际上的微生物称为叶际微生物（phyllosphere microorganisms）[6]。叶际微生物中最丰富的类群是细菌群落，在叶际中以106～107个·cm-2的细胞出现[7]，有些叶际细菌对植物生长发育有积极的促进作用，有些能抑制植物病原菌的生长[8-9]。生活于植物叶际的微生物在植食性动物的取食过程中，必然会大量进入昆虫消化道，可能会对肠道消化系统产生影响。

昆虫的生长发育所需要的营养物质来源于肠道对食物的消化与吸收，昆虫肠道中寄居着细菌、真菌、病毒等大量微生物，这些栖息于宿主消化道内的微生物即为肠道微生物[10]。肠道微生物有助于昆虫对营养物质的吸收[11]、对病原菌的抵御[12-14]以及宿主自身免疫调节[15]等，肠道微生物与宿主之间相互作用，协同进化[16]。Ahn 等[17]发现膜翅目昆虫东方蜜蜂（Apis cerana）和西方蜜蜂 （Apis mellifera）的肠道都是由几种特定的细菌主导，肠道细菌群落可以作为蜜蜂的健康指标[18]。王建梅[19]在3 种蝗虫的肠道中共鉴定出7 门42 科54 属。家蚕虽然取食较为单一，但其肠道菌群也与其他昆虫一样丰富，家蚕肠道微生物主要受食物及其所处的环境影响[20]。孙雪奇等[21]在家蚕中鉴定出253 种细菌，发现家蚕发病率随着用其中部分细菌研制的微生态制剂喂养而降低。Chen 等[22]运用高通量测序技术分析出与野生近缘种相比，家蚕肠道微生物多样且独特。

目前关于温度、食物种类及其营养成分、食物富集的农药等因素对肠道微生物的影响进行了较多的研究。如家蚕经高温处理后肠道微生物显著降低[23]，摄食柘叶的家蚕肠道菌群丰度明显低于摄食桑叶的家蚕[24]，低剂量的农药暴露会导致肠道菌群的变化[25]，这些研究多基于环境条件以及食物的营养成分，揭示叶片微生物通过昆虫的取食行为进入昆虫消化道，对植食性昆虫肠道微生物菌群产生影响的研究则较少。本研究通过对桑叶样品和家蚕肠道样品总DNA 提取并进行高通量测序，分析桑叶叶际和家蚕肠道细菌群落结构的异同以及取食桑叶过程中家蚕肠道各部分微生物群落的变化，以期为研究叶际微生物对家蚕肠道微生物的影响以及提高家蚕的经济价值、减少病害提供基础。

1 材料与方法

1.1 样本的采集和处理

1.1.1 桑树叶片采集 桑叶样本采集自安徽省合肥市蜀山区安徽大学磬苑校区。用无菌手套采集新鲜的桑树叶片，将其放入已灭菌的自封袋中，并立即放入4 ℃冰盒保存，带回实验室。所采集的桑叶一部分存储于-20 ℃冰箱内用于叶际微生物提取，另一部分叶片用于饲喂家蚕。

1.1.2 试虫来源及处理 供试家蚕（B.mori）品种为菁松×皓月，源自安徽省安庆市太湖蚕种场。按照常规方法进行催青，1～5 龄饲养温度保持在26～28 ℃，用所采集的桑树叶片饲喂。

1.2 样本微生物总DNA 的提取

1.2.1 桑树叶片叶际微生物总DNA 提取 分别取8.0 g 样品入100 mL 无菌水中，于37 ℃，120 r·min-1摇床振荡30 min，超声波振荡（40 kHz）10 min，在无菌操作台中，用真空抽滤装置将混合液中的微生物收到0.22 μm 的滤膜上，用CTAB 法提取滤膜上的微生物总DNA。

1.2.2 家蚕肠道微生物总DNA 提取 幼虫成长到5 龄第3 天时，于喂食4 h 后，从100 只桑蚕中随机选取健康大小一致的15 只幼虫进行样本解剖，解剖前先用70%乙醇对家蚕幼虫表面进行消毒，再用蒸馏水冲洗，去除其上残留的乙醇[26-27]， 在超净工作台中取出前、中、后肠的肠道内容物（每段肠道内均含有食物），每5 只蚕的同一段肠道内容物装入同一个已灭菌的离心管内，采用 CTAB 方法对样本的基因组 DNA 进行提取[28]。

1.3 16S rRNA 基因的测序

选择引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAG CAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTW TCTT AA T-3'）用于扩增细菌16S rDNA 的V3—V4 区域。PCR 反应体系（25.0 μL）：2 × Phusion Master Mix 12.5 μL，1 μmol·L-1上下游引物各2.5 μL，DNA 模板50 ng，加ddH2O 至25 μL。PCR 扩增程序：98 °C 30 s；98°C 10 s，54 °C 30 s，72 °C 45 s，35 个循环；最后72 °C 延伸10 min。将扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物纯化效果，得到的PCR 产物由联川生物技术股份有限公司的Illumina HiSeq（PE300）测序平台系统测序。

用 QIIME 软件执行序列过滤，以保证分析结果准确性。去除注释为“叶绿体”、“线粒体”或“未知”（无法注释到界级别的序列）的序列。操作分类单元 (OTU, operational taxonomic unit) 以 97% 的相似性进行聚类，并根据用于16S rRNA 分析的SILVA 数据库执行 OTU 挑选和分类分配[29]，未与做参考的预期区域对齐的序列作为嵌合体被移除。

1.4 统计分析

使用SPSS 22.0 软件，采用Kruskal-Wallis 检验分析α 多样性指数差异。通过非度量多维标度(NMDS)和相似性分析（ANOSIM，排列 = 999） 分析给定样本之间细菌群落组成的差异，使用R 语言Vegan 包作出。使用R 语言中Venn Diagram 包作Venn 图。使用Excel 2016 软件做细菌优势门、科的相对丰度堆积柱状图。使用PICRUSt 软件通过KEGG 数据库进行家蚕肠道菌群的功能预测[30]。使用R 语言Heatmap 包作细菌优势属和功能的相对丰度热图。

2 结果与分析

2.1 桑叶和家蚕肠道微生物多样性

本研究对桑叶和家蚕共12 个样品测序，总共检索到 131 090 个经过质量过滤和去除嵌合序列后的细菌序列，样品的序列范围为5 442 至18 063。桑叶叶际和家蚕肠道共检出4 186 个OTU，其中桑叶和家蚕的前、中、后肠中分别有1 373、587、1 059和1 675个OTU。 桑叶与家蚕共有39个OTU，桑叶独特的OTU 占82.37%。家蚕前、中和后肠共享了64 个OTU，家蚕肠道各个部分都有自己独特的 OTU，尤其是中肠，其独特的OTU 个数占观察到OTU 总数的84.0%，前肠和后肠的独特OTU 分别占71.6%和81.3%（图1）。

α多样性能反映出单个样本内部的物种多样性（表1），Chao1 指数和Ace 指数反映样本中细菌群落的丰富度，桑叶叶际中Chao 1 指数和Ace 指数与家蚕肠道各部位无显著差异；家蚕肠道中前肠与后肠差异显著（P＜ 0.05），肠道各部位数值后肠 ＞ 中肠 ＞ 前肠。Shannon 指数和Simpson 指数反映样本中细菌群落多样性，桑叶叶际与家蚕肠道（前肠、中肠、后肠）的Shannon 指数和Simpson 指数数值差别不大，其中家蚕中肠Shannon 指数和Simpson指数均大于桑叶叶际。家蚕肠道各部位Shannon 指数和Simpson 指数数值中肠 ＞ 前肠 ＞ 后肠。

表1 桑叶叶际和家蚕肠道细菌α 多样性指数Table 1 Alpha diversity indexes of bacteria in phyllosphere of mulberry leaf and silkworm intestine

β多样性可以反映不同样本组间的差异，在OTU 水平上进行NMDS 分析并基于 ANOSIM( analysis of similarities) 进行组间差异检验，发现桑叶样本与家蚕肠道样本单独聚类，两者间差异显著（P＜ 0.05），家蚕肠道各部位样本之间存在交叉聚类，前、中、后肠三者间的差异不显著（P＞ 0.05）（表2 和图2）。

表2 桑叶叶际及家蚕肠道细菌不同分组样本OTU 组成的相似性分析Table 2 Analysis of similarities ( ANOSIM) of the OTU composition of the bacteria in phyllosphere of mulberry leaf and silkworm intestine

2.2 桑叶叶际和家蚕肠道细菌群落的组成

桑叶叶际和家蚕肠道（前肠、中肠和后肠）细菌的 16S rDNA 基因序列共涉及 29 个门：其中优势的细菌门主要包括变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）、异常球菌-栖热菌门（Deinococcus-Thermus）、蓝细菌门（Cyanobacteria）等（图3）。这些门类在不同组织样本中所占的比例不同，在桑叶叶际和家蚕后肠样本中的优势门类为变形菌门（42.69%vs.64.64%）、厚壁菌门（26.45%vs. 23.53%）、放线菌门（13.69%vs. 6.10%）、拟杆菌门（13.11%vs. 4.57%）。家蚕前肠和中肠样本中的优势门类为变形菌门（65.90%vs. 55.49%） 、厚壁菌门（24.16%vs. 23.53%）、拟杆菌门 （6.29%vs.9.00%）和放线菌门（2.64%vs.7.65%）。4 组中变形菌门的平均相对丰度最高，且其在家蚕肠道中的占比高于在桑叶叶际中的占比。

桑叶叶际和家蚕肠道（前肠、中肠和后肠）细菌的 16S rDNA 基因序列共涉及到268 个属。在属的水平上分析每组前10 个优势属的丰度（图4），叶际细菌与家蚕肠道细菌群落结构表现出显著差异，桑叶叶际细菌优势属主要为芽孢杆菌属Bacillus（24.57%）、薄层菌属Hymenobacter（12.45%）、节杆菌属Arthrobacter（11.30%）等。而家蚕肠道细菌优势属为鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas、泛菌属Pantoea、乳球菌属Lactococcus等。此外，家蚕肠道不同部位的细菌优势属也有所不同：家蚕前肠细菌优势属为泛菌属（24.29%）、乳球菌属（6.57%）和鞘氨醇单胞菌属（5.36%）。家蚕中肠细菌优势属为鞘氨醇单胞菌属（14.92%）、乳球菌属（5.06%）和乳酸杆菌属Limnobacter（3.60%）。家蚕后肠细菌优势属为鞘氨醇单胞菌属（12.76%）、厌氧芽胞杆菌属Anoxybacillus（6.29%）和乳杆菌属Lactobacillus（5.16%）。

家蚕前肠、中肠和后肠菌群丰度差异较大（图5），前肠中的泛菌属、水小杆菌属Aquabacterium、Ottowia、鞘氨醇杆菌属、葡萄球菌属Staphylococcus和金黄杆菌属Chryseobacterium在前肠的丰度显著高于中、后肠；中肠的沙雷氏菌属Serratia、Ruminococcaceae UCG-002、Ruminococcaceae UCG-014、拟杆菌属Bacteroides、栖水菌属Enhydrobacter和嗜血杆菌属Haemophilus在中肠的丰度显著高于前、后肠；后肠的Pedobacter、肠杆菌属Enterobacter、短芽孢杆菌属Brevibacillus、链球菌属Streptococcus、厌氧芽孢杆菌属和戴尔福特菌属Delftia在后肠中显著高于前、中肠。前肠与中肠中乳酸杆菌属（2.28%vs. 3.60%）、Cloacibacterium（1.08%vs. 1.92%）、微小杆菌属Exiguobacterium（2.20%vs. 2.34%）、丙酸杆菌属Propionibacterium（0.74%vs. 0.74%）、乳球菌属（6.57%vs. 5.06%）、副球菌属Paracoccus（1.59%vs. 1.18%）、氢嗜菌属Hydrogenophaga（0.61%vs. 0.53% ）和Vogesella（1.84%vs. 1.96%）丰度相似。前肠与后肠中乳杆菌属（5.18%vs. 5.16%）、类芽孢杆菌属Paenibacillus（0.80%vs. 0.80%）、气单胞杆菌属Aeromonas（1.61%vs.1.07%）和苍白杆菌属Ochrobactrum（2.51%vs. 1.71%）丰度相似。

2.3 家蚕肠道菌群功能预测

通过功能预测可以推测出家蚕肠道细菌群落的功能信息，在二级通路中共获得35 个功能，对代谢、免疫和疾病相关的部分功能菌群进行聚类分析（图6）。通过组间聚类可知，3 组样本被划分为2 个亚群分支：家蚕肠道中前肠和中肠构成一支，它们与后肠单独构成一支。表明家蚕肠道的前肠和中肠的微生物群落组成相似，而与后肠的差异较大。消化系统、免疫系统、能量代谢、代谢性疾病和传染性疾病在家蚕前、中、后肠中的占比呈递减趋势，氨基酸代谢、碳水化合物代谢、神经退行性疾病、免疫系统疾病、脂类代谢、其他氨基酸代谢、心血管疾病和核苷酸代谢在家蚕前、中、后肠中的占比呈增高趋势。

3 讨论与结论

本研究通过Illumina MiSeq 技术，对桑叶叶际以及家蚕肠道细菌群落进行高通量测序，发现桑叶叶际与家蚕肠道细菌前4 个优势门类一致，为变形菌门、厚壁菌门、放线菌门和拟杆菌门，这与已报道的多种叶际及昆虫肠道核心细菌类群一致[27,31-35]。如Redford 等[31]对美国科罗拉多州的56 个树种的叶际细菌群落进行研究，结果表明变形菌门、放线菌门以及厚壁菌门是优势类群；Kembel 等[32]发现新热带森林57 个物种共 137 棵树的叶际细菌群落构成多以变形菌门、放线菌门、拟杆菌门为主；张静雨等[36]发现柞蚕5 龄幼虫中肠中厚壁菌门，变形菌门和放线菌门均为优势菌门，拟杆菌门含量较低；Sun 等[37]发现健康家蚕5 龄幼虫的肠道内容物中最丰富的门为厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和拟杆菌门；Chen等[22]对家蚕不同龄期的肠道细菌进行研究，结果表明变形菌门、放线菌门、拟杆菌门和厚壁菌门为优势菌门。对叶际与肠道4 组样本优势细菌门的相对丰度进行差异检验，发现前4 个优势菌门均没有显著差异，但异常球菌-栖热菌门的相对丰度在叶际与肠道间存在显著差异（P＜ 0.05）。异常球菌-栖热菌门作为叶际细菌的优势门类，叶际中的异常球菌-栖热菌门的相对丰度远高于家蚕肠道。鉴于家蚕肠道内微生物比桑叶叶际微生物具有更高的多样性[22]，推测肠道内具有更高的细菌多样性，导致该门在肠道中的相对丰度占比降低。

在属水平上，桑叶与家蚕肠道优势属存在较大的差异，桑叶叶际细菌前3 个优势属主要为芽孢杆菌属、薄层菌属和节杆菌属，而家蚕肠道细菌优势属为鞘氨醇单胞菌属、泛菌属和乳球菌属。桑叶叶际中含量最高的芽孢杆菌属隶属于芽孢杆菌科，该属的部分种类能促进植物的生长和防治植物病害，例如芽孢杆菌能缓解水稻受干旱的胁迫作用，保护烟草和辣椒叶免受病原菌的侵害[39-40]，因此可以推测芽孢杆菌属可能同样能促进桑叶生长发育及防御疾病。值得关注的是，尽管芽孢杆菌属一些种类能够促进植物生长，但它的部分种类却是动物肠道的致病菌，例如苏云金芽孢杆菌是常见的蚕病致病菌[38]。本研究中，芽孢杆菌属在家蚕肠道中占比较低，推测一方面家蚕肠道微生物比桑叶叶际微生物具有更高的多样性，导致该属在肠道中相对丰度占比降低；另一方面，肠道中的某些微生物具有抵抗病原菌的作用[12]，推测家蚕在消化桑叶的过程中肠道微生物减少了所食桑叶中的病原菌。桑叶叶际中鞘氨醇单胞菌属的含量也较高，有研究表明叶际中的鞘氨醇单胞菌属具有预防紫外线辐射以及抵御叶片病原菌的能力，如鞘氨醇单胞菌可以显著降低病原菌的生长，增强对叶片致病菌丁香假单胞菌的抵御能力[41-42]。本研究中家蚕肠道中含量最高的属为鞘氨醇单胞菌属，该属的一些种类会增强宿主肠道消化和免疫反应，对宿主的肠道健康有积极影响[43]。推测家蚕肠道中丰富的鞘氨醇单胞菌属细菌能促进家蚕对营养的吸收及自身免疫调节。

家蚕前肠、中肠和后肠优势菌群丰度差异较大。前肠中的泛菌属的相对丰度显著高于中肠和后肠，有研究证实了某些泛菌属属于植物的致病菌[44]，推测家蚕肠道中的致病菌通过摄食获取。前肠中的乳球菌属、乳杆菌属相对丰度与后肠相似且高于中肠，两属中某些种类是常见的肠道益生菌，可以保持宿主肠道健康生态系统的稳定，从而维护宿主健康，防御疾病[45-46]。中肠中沙雷氏菌属的相对丰度高于前肠和后肠，该属隶属于肠杆菌科，广泛分布在自然界中，是动物肠道的条件致病菌[47]。Ruminococcaceae UCG-002和Ruminococcaceae UCG-014在中肠中也具有较高的丰度，这两个细菌属隶属于瘤胃菌科，其对肠道中的纤维降解过程和食物的消化吸收具有重要作用[48]，如在鳞翅目昆虫肠道中，中肠是消化吸收食物的主要场所，具有大量促进分解的细菌[20]。家蚕后肠中短芽孢杆菌属和链球菌属相对丰度高于前肠和中肠，这两个菌属是动物肠道致病菌，推测家蚕通过取食等行为从环境中获取了致病菌后在后肠中进行富集积累。

功能预测结果显示消化系统和能量代谢在家蚕的前肠、中肠中占比较高，这与鳞翅目昆虫肠道结构有关，其前肠的主要功能是存储和初步分解食物，中肠的主要功能是消化吸收食物，后肠的主要功能是进一步消化食物，并进行相关代谢活动[20]。传染性疾病、代谢性疾病和免疫系统在前肠中具有较高的占比，在中肠和后肠中逐步递减，推测在家蚕取食的过程中获得致病菌，前肠和中肠中的益生菌增强了宿主的免疫功能，维持了宿主消化系统的健康。氨基酸代谢、碳水化合物代谢、脂类代谢和核苷酸代谢在家蚕的后肠中占比较高，这表明后肠主要参与糖类、蛋白质、脂类等化合物生物合成和代谢转化。

综上所述，家蚕肠道细菌群落与叶际细菌群落前4 个优势菌门一致，均为变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门；桑叶叶际细菌优势属主要为芽孢杆菌属、薄层菌属和节杆菌属，家蚕肠道细菌则为鞘氨醇单胞菌属、泛菌属和乳球菌属，这些优势属分别构成了桑叶叶际与家蚕肠道细菌群落的核心；家蚕肠道的前肠和中肠功能菌群相似，与后肠差异较大。