茄子细胞工程技术应用研究进展

贾 利，马绍鋆，江海坤，严从生，王 艳，王明霞，葛治欢，俞飞飞，张其安，董言香，方 凌*

(1. 安徽省农业科学院园艺研究所，合肥 230031；2. 园艺作物种质创制及生理生态安徽省重点实验室，合肥 230031)

茄子（Solanum melongenaL., 2n = 2x = 24）属茄科茄属，是世界上常见的蔬菜作物之一，广泛种植在热带和亚热带地区，也逐渐成为各地区的主要经济作物。然而茄科作物的遗传基础变得日益狭窄，导致新品种培育也日趋遭遇瓶颈，越来越难以满足生产和市场的需求以及环境的变化，同时各种非生物和生物胁迫也长期影响着茄子种植的经济效益[1]。因此，培育优质、高产又具有综合抗性(抗病、抗虫和抗逆)的茄子新品种就成为解决问题的关键。传统育种技术可以改良茄子群体不良性状如植株倒伏、果实畸形、不耐储运、萼片和叶片带刺等，但是耗时较长且效果不佳，同时存在杂交障碍以及优异种质资源匮乏等问题；常见的化学试剂可以有效控制病害，但会产生食品安全、害虫抗性并造成环境污染等其他问题[2]。随着分子生物学和现代生物技术的融合发展，细胞工程技术可以有效解决以上难题，为茄子的品种改良开辟了新途径。

本文从细胞学分析、组织培养和基因工程3 个方面系统总结了国内外关于茄子细胞工程育种技术的研究进展，并对今后的研究方向进行了展望，以期为茄子作物的细胞工程育种技术研究、品种改良和种质创制等方面的研究提供一定的技术参考。

1 细胞学分析

1.1 染色体核型

核型反映了一个物种在其染色体水平的整体特征，其基本方法是基于染色体长度、臂比及核型不对称系数等信息进行[3]，可作为物种分类、亲缘关系辨明和品种鉴定的依据。在茄子杂交育种中，核型背景的研究可为亲本选配和新品种的选育提供可靠的细胞学依据。

目前，茄子的核型研究结果多属于常规的染色体核型分析，即源于体细胞染色体在普通光学显微镜下测定的表型特征。在研究刺天茄的染色体组型时，Krishnappa 等[4]在按照长度将其分为4 类的基础上，又根据初级缢痕和次级缢痕及随体位置的差别划分为17 类。按照上述分类，吴世斌等[5]研究了来自西双版纳的4 份野生茄子和2 个栽培茄品种，发现各野生茄不同种间及同种群间的染色体组型差异较大，栽培茄间则较为相近，且认为具有随体的染色体在全组中的相对长度的位次变化似乎与相对长度有一定关系。

部分茄子野生种与栽培种之间不易区分，作为一个整体称为茄子复合体[6]。Sakata 等通过观察同工酶及叶绿体DNA 谱带，对茄子发育进行了较为系统的研究，发现腥红色的茄子是由野生茄子演化而来的[7]。按照詹园凤等的核型分析标准，研究发现部分野生茄与栽培茄子均为‘2A’型（核型较对称），属于较原始类型，表明它们之间有着密切的亲缘关系和遗传上的同质性[8]。此外，与野生茄相比，栽培茄的核型不对称性增强，不同品种的随体染色体分布位置存在差异[9]。茄子亚属大多数植物都有1对随体染色体[10-11]，少数有2 对和3 对[4,12]，还有一些未发现随体染色体[13]。詹园凤等[14]通过对2 个栽培茄品种‘屏东长茄’和‘紫奇’的核型进行分析，得出‘屏东长茄’的核型公式为2n = 22m + 2sm(2SAT)，染色体相对长度组成为2n = 10M1(中短染色体)+ 14M2(中长染色体)；‘紫奇’的核型公式为2n =20m + 4sm (2SAT)，染色体相对长度组成为2n =14M1(中短染色体)+10M2(中长染色体)；两个品种的染色体数目均为2n = 24，核型均为‘2A’型。林珊珊[15]研究发现‘益丰龙芽’、‘翡翠绿茄’与‘佛源秋茄’3 个秋茄品种的染色体数目均为2n = 24。‘益丰龙芽’的核型公式为2n = 18m + 6sm，为‘2A’型，染色体相对长度组成为 2n = 2L(长染色体)+10M2+10M1+2S(短染色体)；‘翡翠绿茄’核型公式为2n = 18m + 6sm，为‘1A’型，染色体相对长度组成为2n = 2L+10M2 + 8M1 + 4S；‘佛源秋茄’核型公式为2n = 20m + 4sm，为‘1A’型，染色体相对长度组成为2n = 16M2 + 6M1 + 2S。从前人的研究结果可以看出，不同茄子品种之间的核型公式和染色体相对长度组成均存在差异。由于在染色体的结构细节上，不同茄子品种之间表现出不同程度的差异，故而茄子品种外部形态表现出的差异，极有可能来自内部染色体的微小结构变化[14]。

1.2 染色体原位杂交

随着染色体研究技术的创新，建立和发展了分子细胞遗传学，产生了基因组原位杂交(genomic in situ hybridization, 简称 GISH)和荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, 简称FISH)，使得科研工作者可以在单细胞水平分辨染色体。在植物研究中，GISH 多用于分辨种间杂种、异源多倍体和种间渐渗系中来自不同亲本基因组的染色体，并对染色体的组成和变异进行分析[16]。FISH 已主要应用于以下几个方面：（1）特定DNA 序列在染色体上的定位；（2）基因表达研究；（3）物种之间的亲缘关系和多倍体起源；（4）基因组结构及空间分布规律；（5）转基因的细胞学鉴定；（6）检测外源染色体片段及其渗入方式的探讨[17]。

野生优异资源和不同品种基因组的重组利用已成为茄子种质创新的主要途径，而开展染色体工程育种已成为茄子抗病育种的主要突破口[18]，因而进行染色体细胞学研究对于茄子育种具有重要意义。为了将野生水茄的优良性状导入到栽培茄中，曹必好等[19]将二者进行人工杂交，并以野生水茄的基因组为探针，对远缘杂交一代进行GISH 鉴定，发现有较强杂交信号，表明杂种真实性。另外，为了提高马铃薯的抗病性，叶文宣[20]将具有青枯病抗性的茄子与马铃薯普通栽培种进行体细胞融合，通过GISH 清晰地鉴定出杂种染色体的来源后，又利用FISH 研究了染色体的重排，表明在起源关系较远的体细胞杂交中，大部分亲本染色体可以独立存在，但也可以产生双亲重排染色体。

茄科蔬菜中马铃薯、番茄和茄子等几类主要物种的遗传进化关系一直是研究的热门，在此过程中，不断丰富着茄子的染色体细胞学信息。Lou 等[21]利用比较FISH 的方法将马铃薯6 号染色体上的13 个BAC 克隆定位在7 个茄科物种上，发现有11 个可定位于茄子6 号染色体上，一定程度上反应了马铃薯和茄子的同源关系。He 等[22]利用FISH 技术将内部端粒重复序列（interstitial telomeric repeats, 简称ITRs）杂交在马铃薯、番茄以及茄子上，端粒探针信号在各个种染色体上的定位通过中期染色体核型排布来显示，发现该序列主要富集于染色体着丝粒区域，这些结果暗示ITRs 可能与功能着丝粒有关。目前，还未彻底研究清楚茄科主要物种之间的染色体进化关系，可利用比较FISH作图来继续深入研究。

2 组织培养

2.1 外植体培养

20 世纪60 年代，茄子再生体系的研究已有相关的报道。通过外植体器官体外培养获得再生植株是茄子离体再生研究的热点。基因型是影响植株再生最重要的因素，材料的基因型不同，再生能力亦有很大差异。Gleddie 等[23]对7 个茄子品种的体细胞胚进行培养，诱导频率介于5.6% ～ 26.2%。外植体部位对植株再生也有很大影响[24]，研究发现下胚轴易诱导出不定芽，而子叶和真叶更易诱导出体细胞胚[25]。Magioli 等[26]研究认为子叶和真叶再生频率最高，下胚轴次之。姜悬云等[27]通过对7 份茄子子叶和下胚轴进行离体培养，得出子叶的再生效果要优于下胚轴，其中徐州长茄与成都墨茄子叶的再生频率较高，分别是93%和73%，同时下胚轴形态学上端的再生能力要显著强于形态学下端。上述二者的研究结果说明子叶的再生频率高于下胚轴。而余波澜等[28]对4 个茄子品种进行组织培养，得出下胚轴比子叶易诱导出芽的结论，说明基因型和诱导部位均对再生频率有一定的影响。杨志晶[29]以‘云茄6号’的子叶和下胚轴为外植体，结果并未诱导出不定芽的分化，只有带芽的茎段才能分化出芽，不定芽分化率达到86.11%。目前为止，研究人员已利用未成熟的种胚[30-31]、下胚轴[27,31-34]、子叶[27,31,34-37]、真叶[32,38-40]和根[31,41-43]等部位获得再生植株。

除了基因型和外植体部位，培养条件对茄子离体再生也有一定影响。MS 培养基常用于离体培养，研究人员发现基本培养基对茄子组织培养影响不大，关键影响因素是植物激素种类及其比例。不同外植体对激素的要求不同，常用的激素有

1-Naphthylacetic acid (NAA)，Indole-3-acetic acid(IAA)，6-Benzylaminopurine (6-BA)，Kinetin (KT)，Trans-Zeatin (ZT)，2,4-Dichlorophenoxyacetic acid(2,4-D)等，其中生长素和细胞分裂素尤其重要。Rao等[40]利用NAA 诱导产生胚状体并获得了茄子再生植株。赵福宽等[44]研究发现添加2, 4-D 和KT 的培养基对叶肉愈伤组织有很好的诱导作用。余波澜等[28]在培养基中分别添加IAA、ZT 和6-BA 可诱导愈伤的再分化；ZT 对子叶和下胚轴的诱导率较低，不易形成再生植株；6-BA 可诱导芽分化，但高浓度反而会大大降低分化率。此外，因在传统育种中茄子植株在田间常受到各种病害、逆境等不利因素的影响，易导致整株死亡，无法保证在果实成熟时能采收到种子，而导致育种材料缺失。通过离体快繁技术、枝条扦插技术以及未成熟种子成苗技术可以有效解决上述问题，使优异种质资源得以保存。

2.2 花药和小孢子培养

20 世纪70 年代，通过茄子花药离体培养获得单倍体植株就已经成功，且技术较为成熟。在茄子花药培养过程中，发现不同材料、材料的不同生理状态、不同培养条件和环境均会影响花药的培养效果[45]。以七叶茄为试材，程继鸿等[46]研究得出1 000 lx 弱光胁迫下的茄子花药离体再生条件，并获得了植株。邹建[47]通过3 个茄子品种的花药愈伤组织诱导、增殖和分化培养，获得了单倍体植株。李亚荣[48]对10 个基因型的茄子花药进行培养，仅两份材料诱导出胚状体，同时发现5～6 ℃的低温预处理对胚状体诱导有效，3%的蔗糖胚状体诱导率最高。刘独臣等[49]以10 份茄子F1为试材，对花药培养过程中各类条件进行摸索，建立了茄子花药培养诱导胚状体成苗体系。潘羽丰[50]以12 份茄子为试材，通过茄子花药培养，研究出一步诱导获得单倍体植株的方法。方岩岩[51]探讨并得出适宜水茄和紫长茄杂种F1花药培养的因素，为创制DH 系提供了参考依据。Rotino等[52]综合考虑了花药培养所有的技术因素，提出了一套详细的茄子花药培养程序，而且该程序在花药培养的第一阶段进行了35 ℃高温处理。王利英等[53]研究发现，‘红地球’、‘红宝石’、‘黑秀’、‘园丰一号’、‘园丰二号’、‘园丰七号’、‘Y94-2014’、‘Y95-2014’和‘Y107-2014’9 份白肉紫红圆茄的愈伤组织比较容易诱导产生单倍体，诱导率高达69%，‘青丰一号’、‘绿罐 309’等14 份绿茄和‘硕圆黑宝’、‘德润一号’等12 份绿肉紫黑圆茄诱导率为56%，‘长野黑美’、‘改良大龙茄’等8 份紫萼长茄诱导率为 7%，‘布列塔’、‘CC15-2014’、‘CC17-2014’3 份绿萼长茄诱导率为0。通过进一步优化茄子单倍体诱导体系，诱导率平均提高到39%。霍秋月[54]通过构建栽培茄与野生茄杂交F1代的花药培养体系，发现在获得的10 份杂交种中，有6 份杂种能诱导出愈伤组织，为构建茄子DH(双单倍体)系以及将野生茄的抗性基因转入到栽培茄中奠定基础。目前花药培养一直没能广泛成功地用于茄子新品种选育，主要原因是因为茄子诱导单倍体成功率较低，另外通过花药培养获得再生植株的茄子基因型范围较窄，所以导致一些真正有价值的育种材料不能通过花药离体培养获得单倍体再生植株。加之花药整体生理结构较为复杂，没有足够的实验来证明再生植株的来源到底是由哪些部位发展而来。

相较于花药培养，小孢子培养可排除母体干扰性，但其出胚率较低，限制了实践上广泛的应用[55]。此外，有研究发现小孢子体外培养诱导产生二倍体的同时，还有其他多倍体的产生，必须对后代进行倍性的鉴定选择。但小孢子培养是产生双单倍体强有力的生物技术，同时也有利于杂交种子的快速生产[56-57]。研究认为茄科植物对小孢子培养相对敏感，但不同的茄科作物的反应相差很大，烟草小孢子培养发展相对完善，但茄果类蔬菜作物（甜辣椒、番茄、茄子）则很难诱导成苗。影响茄科小孢子培养因素有很多，包括基因型、供体植株生长环境、小孢子发育时期、培养技术以及培养基的成分等在内的诸多因素[58]。

研究发现[59]半乳糖可以诱使烟草花粉分裂，但若缺乏蔗糖，这些分裂的花粉则不能进一步发育分化，茄科农作物小孢子培养所需的蔗糖最适浓度约为2%～4%。低浓度的生长素类物质可提高胚状体的诱导频率，而高浓度则易产生愈伤组织和使细胞倍性复杂化[60]。研究认为，小孢子培养需要诸如高温、低温、营养饥饿、渗透等非生物应激来触发胚胎发生[61]。茄子游离小孢子培养诱导成苗较困难，目前报道很少，仅有少数研究取得一些突破，如顾淑荣[62]从普通栽培品种‘九叶茄’的花粉愈伤组织上分化得到再生植株。Miyoshi[63]研究发现茄子小孢子在无蔗糖培养基中35 ℃处理3 d 是愈伤组织诱导的先决条件。宋彦平等[64]研究得出诱导愈伤组织发生的最佳时期是小孢子单核靠边期，对花药先4 ℃后36 ℃变温预处理，其小孢子膨大率比25 ℃常温高出6 倍多。张玉苗[65]通过对不同茄子材料小孢子脱分化和影响因子进行了相关研究，得出了小孢子单核靠边期的花蕾取样标准以及基因型和单核期花药内源激素含量对小孢子脱分化和胚胎发生过程 有 显 著 影 响 的 结 果。 Corral-Martínez 和Seguí-Simarro[66-67]从茄子小孢子培养中获得了愈伤组织，有60%的DH 植株可以再生，他们在游离小孢子培养过程中以单独或者组合的方式加入了

6-BA、NAA、Abaseisieacid (ABA)、Polyethylene glycol(PEG)和阿拉伯半乳糖蛋白，结果阐明了这些外源物质对小孢子胚胎发生的调节作用，对提高茄子游离小孢子的培养效率有指导作用。朱朝辉等[68]认为黑暗静止培养条件下，定时更换部分培养基有利于茄子小孢子愈伤组织诱导与生长，在MS+ZT 1.5 mg·L-1+ NAA 0.05 mg·L-1培养基中小孢子愈伤组织分化率达到57.78%。

相比较而言，小孢子培养无论是在技术发展还是适用范围以及遗传育种等方面均具有一定的优越性。小孢子离体培养具有较宽的基因型适用范围，其所产生的胚状体均来自小孢子，并且具有自然加倍成二倍体的特点。但由于在小孢子的诱导机制、启动机理、遗传因素等方面缺乏深入的研究以及游离小孢子发育同步性差、不易分化成苗等技术发展不成熟等诸多因素，也同样限制了其在茄子育种中发挥较大的作用。茄子小孢子发育同步性低，愈伤组织诱导率不高，今后需要对小孢子培养本身的发育机理、机制开展一些探究。

2.3 原生质体培养

植物原生质体是指利用特殊手段脱去植物组织细胞壁后剩余的由细胞膜包裹的细胞质以及细胞核等组成的物质，又称细胞原生质团，其保留了细胞一系列特性，细胞结构和生命活力得以保留。在一定特殊条件环境下，会启动细胞壁再生，进而可诱导细胞分裂分化形成新的细胞组织和器官，后经体系转化发育成完整植株。

原生质体是进行遗传操作的理想受体，通过该技术获得体细胞杂种，不仅可以克服杂交不亲和与杂种不育的问题，同时可以实现优良基因在种间转移。“细胞融合”技术是建立在原生质体培养的基础上发展成熟的一门重要学科，其利用细胞的全能性使两个细胞的染色体发生融合的细胞再生细胞壁，进而分化发育形成新植株，经过选择后创制出新品种。目前，茄属植物已经通过叶肉[69-73]、茎[74]、子叶[75]、叶柄[76]等材料获得原生质体并培养出再生植株。茄子主要通过愈伤组织成苗[77]，连勇等[78]利用原生质体电融合技术，经愈伤组织培养获得栽培六叶茄和两个近缘野生种的种间四倍体再生植株，为茄子抗病育种提供新材料。郭欢欢等[79]通过对酶解液浓度、酶解时间以及电融合参数进行研究，建立了野生茄子蒜芥茄和水茄的原生质体融合技术体系。

原生质体培养技术的成熟发展是实现茄远缘物种之间的体细胞杂交、遗传物质的种间交换、改良物种遗传特性技术的基础，培育出新物种的几率大大提升。同时，该技术的成熟发展为推动茄品质改良和提高茄产量奠定了理论基础，大大开辟了茄子育种的新领域。

3 基因工程

3.1 抗性基因转移

在生产栽培中，茄子易受到病虫侵害和不良环境影响，造成产量和品质下降，因而培育优质高产且具有抗性的茄子品种具有重要意义。通过转基因技术可以将抗性基因转移到茄子中，为茄子选育抗虫、抗病和抗逆品种开辟新途径。茄子转基因主要以根和子叶作为外植体，采用农杆菌介导转化，目前国内外已公布了一些体系[80-85]。

茄子抗性基因转化方面的报道有限，主要是目前还缺乏高效的茄子遗传转化体系，转化效率也远远低于同科属的番茄和马铃薯，因此多数研究集中在对抗性基因（抗虫、抗菌、抗除草剂、耐盐等）的初步验证，获得的阳性植株也较少。Arpaia 等[86]将cryⅢB基因成功转入茄子中，验证发现转基因植株可以有效控制马铃薯甲虫(CPB)的侵害；Jelenkovic[87]和Acciarri[88]等分别将cryⅢA基因和cryIAb基因导入茄子，均得到了抗性植株；邹克琴等[89]利用几丁质酶和抗菌肽D 双价基因遗传转化茄子，获得2 株抗菌植株；林栖凤等[90]利用花粉管通道法将海滩耐盐红树的DNA 导入茄子中，并筛选出了耐盐性的转化株；以茄子愈伤组织为材料，王凤华等[91]获得了具有抗除草剂基因(bar)的阳性植株；Prabhavathi 等[81]获得了对盐胁迫、低温胁迫和渗透胁迫的逆境耐受性显著增强的含mtlD基因茄转化株系。孟平红等[92]构建了含冷诱导转录因子CBF3的植物表达载体，并获得2 株耐冷植株。利用pMAT21 载体，Darwish 等[93]以子叶为外植体获得了可以直接应用于育种的无抗性标记基因的转基因植株。张明华等[94]将抗根结线虫Btcry6A基因转入茄子，共获得56 株Kan 抗性植株，其中有15 株为转基因植株，明显提高了对南方根结线虫的抗性。Papolu 等[95]将OC-I△D86基因转入茄子，其后代株系对南方根结线虫的抗性有明显增强。李想等[96]通过农杆菌介导，将GUS基因导入茄，获得了7 株Hyg B 抗性植株，通过检测鉴定均为转基因植株，最高转化率为10%，可作为转基因理想受体材料。胡鑫等[97]以“三月茄”子叶作为外植体，通过筛选激素和抗生素配比，得出农杆菌介导的茄子遗传转化率达到了11.02%，下胚轴为外植体的转化率达到4.38%。尚静[98]以‘卜丽卡’茄子的下胚轴为外植体将具有耐盐功能的转录因子进行遗传转化，结果表明有22 株茄子为SmWRKY40阳性植株，对其功能初步鉴定发现SmWRKY40转录因子在茄子耐盐中具有正调控作用。SmMsrA、SmWRKY40等基因的转基因植株的获得，可为茄子基因功能的研究与基因编辑奠定基础。

3.2 单性结实基因工程

单性结实是茄子的一个优良性状，成为新品种选育追求的重要目标之一。目前，对于茄子单性结实的研究，已从对单性结实性状的生理基础、遗传规律的调查分析逐渐转变为对单性结实分子机理的探究，如筛选与单性结实相关的关键基因，基因的克隆、表达模式分析和功能验证等，可为茄子新品种选育技术提供新的思路，有望实现新的突破[99]。

目前获得途径主要有植物激素诱导、培育三倍体以及利用自然变异和基因工程手段，并取得了较好的进展，也选育出一些单性结实新品种。传统方法存在品种少和诱导条件不易等问题，相比之下，基因工程是最为有效的技术。Rotino 等[100]采用转基因技术，将生长素合成基因导入茄子中，获得的株系单性结实坐果率为100%，该方法已得到广泛利用[101-102]。

目前，茄子基因组草图的完成意味着茄子分子遗传育种研究迎来新的开始，多个与茄子单性结实相关的功能基因被陆续克隆，人们对其生物学功能的挖掘也在不断深入。杜黎明等[103]通过RT-PCR 和cDNA 末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，RACE）从杭州红茄中获得了一个与生长素响应因子家族基因SmARF8，其与拟南芥和番茄单性结实调控基因都具有较高的相似性。张伟伟等[104]以SSH 文库差异表达EST 片段Z732 为基础，通过 RACE 技术克隆了茄子生长素诱导基因SmIAA19全长，基因表达分析表明该基因可能与茄子单性结实有关。张立慧[105]克隆得到茄子中ARF6、ARF7、ARF8、GH3.6 和IAA9共5 个与单性结实相关的生长素类基因，通过基因差异表达分析，得出3 个基因ARF6、ARF7和ARF8主要参与了D-7-1品系的花发育与坐果。

传统的生物技术培育的作物品种中已逐渐被通过基因转化技术诱导产生抗病、抗虫、高产等具有优良性状的新品种所取代。在今后的茄子育种工作中，将逐步开展有关分子标记和功能基因定位、克隆和转化的研究，通过分子标记辅助选择和QTL 作图构建基因图谱，在引进和收集茄种质资源的基础上鉴定其亲缘关系的远近，有利于定向育种，高效选育新品种。

综上所述，目前国内外茄子细胞工程技术已取得了一系列的研究进展，也证实了细胞学、组织培养和转基因等技术手段在茄子遗传育种应用中具有广泛的前景。

4 展望

茄子细胞工程技术中依然存在很多值得研究和解决的问题，笔者总结出以下3 个方面：（1）细胞学分析方面：茄子的核型分析相关研究较少；栽培茄品种之间核型差异和外部形态差异二者之间的相关性和机理尚未明确；茄子种间和种内的遗传进化关系研究与应用等需要进一步深入研究。（2）组织培养方面：为拓展茄子的遗传背景，加快茄子新品种选育，需加强原生质体融合、花药与小孢子培养技术等和常规育种技术相结合开展种质创新；茄子雄配子的启动机理和高频率诱导机制。（3）基因工程方面：加强茄子野生近缘种抗病基因的深入挖掘；挖掘茄子重要性状相关基因的克隆；高效的茄子受体再生途径和稳定的遗传转化体系、茄子基因编辑技术。对细胞工程技术的深入研究和不断进步必将弥补常规育种的不足，可有效促进茄子新品种的选育及相关品种改良的发展。