阿魏酸通过磷酸肌醇3激酶/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶途径保护大鼠免受心肌缺血/再灌注损伤

朱舜明，张荣怀，张学军，邴森

作者单位：1陕西省人民医院心内一科，陕西 西安 710068；2西安市第三医院心内科，陕西 西安 710068

急性心肌缺血后，通过药物或机械干预恢复病人冠状动脉血流（再灌注）对于挽救病人心肌功能至关重要［1］；但再灌注会引发病人机体局部氧化爆发和高水平炎症反应，进而引起心肌细胞损伤和细胞死亡，造成“再灌注损伤”［2］。改善急性心肌梗死的临床结局，探索减轻缺血-再灌注（Ischemia/Reperfusion，I/R）损伤的新型治疗药物，对于该病的临床诊断和治疗至关重要［3］。

阿魏酸（Ferulic acid）是一种广泛存在的酚类化合物，在诸如坚果、西红柿和当归（Angelica sinensis）等植物中均有发现，其对多种疾病具有良好的治疗活性［2］。阿魏酸能够通过抑制环氧合酶（COX-2）、前列腺素E2（PGE2）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）改善血管内皮功能［4］。此外，阿魏酸通过降低活性氧（ROS）水平，进而预防慢性炎症性疾病［5］。但对阿魏酸在心肌I/R所致细胞损伤中的作用目前仍未引起足够关注。

凋亡是程序性细胞死亡的主要类型，与I/R损伤紧密相关［6-7］。胱天蛋白酶（caspase）是介导程序性细胞死亡信号级联反应的关键因子，其中caspase-3被认为是重要的凋亡启动子［8］。尽管已证实磷酸肌醇3激酶/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Phosphoinositide 3-kinase/serine/threonine protein kinase，PI3K/Akt）途径调控着细胞增殖、分化和凋亡［9］，但其在阿魏酸发挥神经保护作用中的分子机制还有待研究。

本研究自2018年10月至2019年7月通过结扎大鼠左冠状动脉前降支法构建心肌缺血再灌注大鼠模型，探究阿魏酸和PI3K/Akt的作用关系。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和实验动物阿魏酸和LY294002购于美国Sigma Chemical公司。PI3K和Akt酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购于美国Cusabio Biotech公司。末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP-生物素缺口末端标记（TUNEL）细胞凋亡检测试剂盒购于德国Roche Diagnostics公司。抗MDA5、SOD1、TNFα、IL-6、IL-1β、Caspase-3、Cleaved caspase-3、PI3K、p-Akt（Ser473）、Akt、eNOS、p-eNOS（Ser1177）、p-mTOR（Ser2448）和β-actin蛋白一抗购于美国Cell Signaling Technology公司。BCA蛋白定量分析试剂盒和二抗购于中国Beyotime Biotechnology公司。其余试剂均为分析纯。雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（200～220 g）由陕西省人民医院［SYXK（陕）2016-006］提供。本研究符合一般动物实验伦理学原则。

1.2 方法

1.2.1 实验动物及分组所有实验大鼠均可自由进食和饮水，饲养温度22～24°C，湿度50%～60%，12 h明暗循环。48只大鼠采用随机数字表法分为4组（n=12）：（1）假手术组（sham组）；（2）I/R模型组（I/R组）；（3）阿魏酸+I/R组（Fer+I/R组）；（4）阿魏酸+LY294002+I/R组（Fer+LY+I/R组）。

1.2.2 I/R大鼠模型建立及给药处理通过腹膜内注射戊巴比妥钠（45 mg/kg），待大鼠完全麻醉后，仰卧位固定。再分别接入动物呼吸机以及心电监护仪，于大鼠胸部左侧第5根肋骨处纵向切开，钝性分离肌肉组织，暴露胸腔。剪开心包膜后，用6-0丝线将冠状动脉左前降支（LAD）结扎。当监护仪指标显示脉搏减弱、左心室心肌颜色发白，并且其心电图的ST段显著抬高，表示结扎成功。结扎30 min后持续对大鼠灌注3 h，当ST段出现50%以上回落，则判定为I/R大鼠模型建立成功。

假手术组大鼠仅打开胸腔，不结扎。在I/R建模30 min前，假手术组和I/R组按100 mg/kg腹膜注射0.9%氯化钠注射液，Fer+I/R组大鼠腹膜内注射阿魏酸（10 mg/kg）。Fer+LY+I/R组大鼠在I/R建模30 min前腹膜内注射阿魏酸（10 mg/kg），再于麻醉后，LAD结扎前，通过尾静脉注射LY294002（0.3 mg/kg）。

1.2.3 HE染色脊椎脱臼法处死大鼠后，暴露胸腔后取出心脏，使用预冷生理盐水清洗，去除大血管及结缔组织，用滤纸拭干。再将大鼠左心室心肌用4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，横向切成4 μm厚切片，并用苏木精-伊红（HE）染色，在光学显微镜（IX51，Olympus，日本）下观察。病变程度量化：（-）无病变；（+）局部病变；（++）零星散布病变；（+++）融合性病变；（++++）大量块状病变。

1.2.4 TUNEL法检测心肌细胞凋亡各组大鼠心脏组织经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋后切片，使用商业试剂盒（Roche）进行TUNEL测定，以评估不同组大鼠心肌细胞凋亡程度。Fluorescein-dUTP着色为凋亡细胞数，呈绿色；4'，6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）着色为总细胞数，呈蓝色。为确定心肌细胞凋亡程度，每组随机选择6个视野（×200），使用Image Pro Plus 6.0计算细胞凋亡指数（apoptotic index，AI），AI=凋亡细胞数/总细胞数。

1.2.5 心肌超微结构观察分离大鼠心脏组织，先用磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L，pH 7.4）清洗，再于4°C磷酸盐缓冲液中用1%四氧化锇固定2 h。使用Araldite CY212包埋后，通过超薄切片机（Ultracut E，Reichert，奥地利）制备70～80 nm超薄切片。再用乙酸铀酰和乙酸铅染色，在透射电子显微镜（Morgagni 268D，FeiCo，荷兰）下观察记录各组心肌细胞形态轮廓，线粒体和细胞核结构，以及闰盘Z线变化情况。

1.2.6 ELISA检测按照试剂盒说明书要求，使用PI3K和Akt ELISA试剂盒检测各组大鼠心肌组织中PI3K和Akt表达水平。

1.2.7 蛋白质印迹法（Western blotting）处死大鼠后开胸取出心脏，称取约200 mg心脏组织，剪碎并用磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L，pH 7.4）清洗。再加入预冷RIPA裂解缓冲液提取总蛋白；裂解液在4℃、12 000 r/min离心5 min。使用BCA蛋白定量试剂盒测定总蛋白质浓度。将等量的蛋白样品通过SDSPAGE电泳分离，再转移到PVDF膜。将膜与5%脱脂牛奶在Tris缓冲液中4℃孵育过夜封闭。封闭膜后，再与抗MDA5、SOD1、TNF-α、IL-6、IL-1β、Caspase-3、Cleaved caspase-3、PI3K、p-Akt（Ser 473）、Akt、eNOS、p-eNOS（Ser1177）、p-mTOR（Ser2448）和β-actin一抗孵育过夜。用TBST洗涤3次，再与辣根过氧化物酶偶联的IgG室温孵育1 h。使用ECLPLUS系统检查蛋白质表达水平变化情况。通过Image Pro Plus 6.0软件进行灰度分析。

1.3 统计学方法所有计量数据均表示为±s，使用SPSS 16.0软件进行数据分析；多组数据比较采用单因素方差分析，多组间两两比较SNK-q法。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 阿魏酸干预明显减轻I/R大鼠心脏组织病理学变化通过苏木精-伊红染色对I/R诱导损伤和阿魏酸干预对大鼠心脏组织损害程度进行分析。染色结果显示，相较于假手术组，I/R组大鼠心肌中表现出明显的炎性细胞浸润、细胞膜损伤、细胞坏死和水肿。在Fer+I/R组大鼠中，心肌细胞坏死、炎性细胞浸润，及细胞水肿病变均明显低于I/R组，且心肌纤维结构更清晰完整（图1和表1）。

表1 不同实验组大鼠心肌组织病理学分级

2.2 阿魏酸干预抑制I/R大鼠心肌细胞凋亡TUNEL/DAPI双 重 染 色 结 果 显 示，I/R组［（55.45±1.14）%］大鼠存在严重的心肌组织损伤，Fer+I/R组［（18.73±1.01）%］大鼠TUNEL阳性心肌细胞百分比明显低于I/R组（P＜0.001）；Fer+LY+I/R组［（46.81±1.56）%］凋 亡 指 数 明 显 高 于Fer+I/R组（P＜0.01）（图2）。

Western blotting分析结果表明，与I/R组（3.98±0.28）相比，Fer+I/R组（2.01±0.14）大鼠活性Cleaved caspase-3蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），而Fer+LY+I/R组（3.76±0.25）大鼠Cleaved caspase-3蛋白表达高于Fer+I/R组（P＜0.05）（图3）。

图3 阿魏酸显著抑制I/R诱导大鼠心肌细胞凋亡的Cleaved caspase-3免疫印迹结果

2.3 阿魏酸干预显著激活PI3K/Akt信号通路心肌组织PI3K和Akt蛋白ELISA检测结果显示，I/R组［PI3K：（14.58±0.96）ng/L；Akt：（0.27±0.07）μg/L］大鼠心肌组织中PI3K和Akt蛋白表达水平均低于假手术 组［PI3K：（21.32±1.26）ng/L；Akt：（0.38±0.08）μg/L］；Fer+I/R组［PI3K：（27.52±2.73）ng/L；Akt：（0.72±0.15）μg/L］大鼠PI3K和Akt蛋白表达水平均明显高于I/R组（P＜0.05）。

PI3K/Akt信号通路各蛋白Western blotting检测结果显示，与假手术组相比，I/R组大鼠PI3K、p-Akt和Akt蛋白表达水平明显下调，PI3K/Akt信号通路下游靶标p-eNOS（Ser1177）和p-mTOR（Ser2448）蛋白表达水平也明显低于假手术组（P＜0.05）；而Fer+I/R组上述蛋白表达水平均高于I/R组（P＜0.05）（图4和表2）。

表2 PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达水平

图4 PI3K/Akt信号通路相关蛋白的蛋白质印迹检测

2.4 阿魏酸干预可保护I/R损伤后大鼠心肌结构完整性TEM心肌超微结构分析结果显示，与假手术组相比，I/R组大鼠出现明显肌原纤维变性、线粒体肿胀、不规则线粒，以及心肌细胞闰盘Z线扭曲。在Fer+I/R组大鼠中，心肌细胞核及其线粒体结构均保持完整，没有明显的肌原纤维变性，与假手术组大鼠心肌组织结构相近。而Fer+LY+I/R组大鼠心肌组织细胞排列紊乱，有明显心肌纤维断裂，细胞变性坏死严重，其心肌超微结构病变与I/R组相似（图5）。

图5 阿魏酸显著改善I/R大鼠心肌超微结构：A为假手术组；B为I/R组；C为Fer+I/R组；D为Fer+LY+I/R组。

2.5 阿魏酸干预抑制I/R大鼠氧化应激和炎症反应Western blotting分析结果显示，与假手术组相比，I/R组大鼠MDA5蛋白表达水平，促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），SOD1蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）。与I/R组相比，Fer+I/R组大鼠MDA5、TNF-α、IL-6和IL-1β蛋白表达水平均显著下调（P＜0.05），SOD1蛋白表达水平明显上调（P＜0.05）。而与Fer+I/R组相比，Fer+LY+I/R组 大 鼠SOD1含 量 明 显 下 调，MDA5、TNF-α、IL-6和IL-1β蛋白表达表达水平显著上调（P＜0.05）（图6和表3）。

表3 I/R大鼠氧化应激和炎症反应相关蛋白的表达水平

图6 阿魏酸显著抑制I/R大鼠氧化应激和炎症反应水平

3 讨论

I/R是一个复杂的病理生理过程，涉及细胞凋亡、炎症反应和氧化应激调控［10］。研究显示诱导I/R后，大鼠心肌细胞损伤明显，出现典型的细胞凋亡表型［11］；与永久性缺血大鼠相比，再灌注大鼠心肌细胞凋亡率也显著增加［12］。

I/R可能激活casepase凋亡蛋白级联反应。其中，caspase-3是细胞凋亡的重要调控因子，活性caspasse-3直接参与诱导蛋白质、酶和DNA等生物活性大分子降解。紫草素（Shikonin）和褪黑素（Melatonin）通过下调caspase-3表达，抑制内质网应激诱导的心肌细胞凋亡，明显缓解I/R模型动物心肌损伤［13-14］。本研究TUNEL/DAPI双重染色及Western blotting实验结果显示，假手术组大鼠未检测到心肌组织caspase-3过度激活；阿魏酸干预能显著下调I/R大鼠活性caspase-3蛋白表达水平，抑制心肌细胞凋亡，以减轻I/R大鼠再灌注期间心肌组织病理损伤。这表明，抑制I/R后心肌细胞凋亡是阿魏酸损伤发挥心脏保护作用的机制之一。

心肌再灌注期间通过激活PI3K/Akt信号通路，降低氧化应激，抑制炎症级联反应以及抑制心肌细胞凋亡，可以明显降低I/R损伤的发病率和死亡率［15-16］。受PI3K调控的Akt在Ser473位点磷酸化后激活［17］，产生p-Akt，进一步刺激下游效应靶标，如eNOS、mTOR、NF-κB、Bcl-2蛋白家族和caspase蛋白家族［18］，调节细胞凋亡和细胞转录活性，以提高心肌细胞存活率［9］。其中，eNOS磷酸化及其产生的NO在Akt介导的抗凋亡作用中发挥着关键作用［19］。因此，本研究研究了阿魏酸干预对PI3K/Akt信号通路关键调控蛋白表达的影响。免疫组化和蛋白质印迹检测结果显示，eNOS磷酸化水平增加与PI3K蛋白上调和Akt磷酸化同时发生。LY294002是一种特异性阻断PI3K细胞信号传导通路的蛋白激酶抑制剂［20］，结合TEM心肌超微结构分析，发现Fer+I/R组大鼠心肌细胞核及其线粒体结构均保持完整；而阿魏酸+LY294002组观察到明显肌原纤维变性、线粒体结构不规则，以及Z线扭曲。LY294002处理逆转了阿魏酸对I/R大鼠心肌细胞的保护作用。上述结果表明，阿魏酸通过激活PI3K/Akt/eNOS途径保护I/R大鼠心脏免受I/R诱导损伤。

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）是一种重要的抗氧化金属酶，通过调控胞内活性氧水平，在信号转导和物质代谢过程中发挥着重要作用［21］。细胞氧化应激失衡导致丙二醛（malondialdehyde，MDA）不断积累，对线粒体和溶酶体造成不可逆损伤［22］。IL-6、IL-1β和TNF-α等分泌型炎症调控因子表达水平失衡会明显加剧I/R病理发展［23］。本文实验结果显示，阿魏酸明显抑制I/R大鼠MDA5、TNF-α、IL-6和IL-1β蛋白质表达，并上调SOD1蛋白水平。这表明阿魏酸对I/R大鼠发挥心脏保护作用与其抗炎和抗氧化特性有关。

本研究也存在一定局限性。首先，尽管选择使用LY294002阻断PI3K/Akt信号通路，但关于LY294002是否对心肌组织存在影响并没有做详细的研究。在后续研究中，我们也将以大鼠为动物模型，进一步分析LY294002对大鼠心肌组织的作用，以期能够更为全面地解析阿魏酸对PI3K/Akt途径与大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响关系。其次，本文结果仍需要结合临床研究数据做进一步佐证。

综上，阿魏酸干预可有效预防I/R大鼠心肌损伤。阿魏酸通过激活PI3K/AKT信号通路，减少心肌细胞凋亡，抑制炎症反应和氧化应激水平，以缓解I/R诱导心肌损伤。在未来，阿魏酸有望为临床预防I/R心肌损伤提供新的思路。