肉灵芝提取物调控长链非编码RNA BRCA1相邻基因2/双特异性磷酸酶4/细胞外信号调节激酶通路对肝癌细胞Hep3B增殖及凋亡的影响

李霞，李慧，许聪聪，李军峰，张冬冬

作者单位：1枣庄矿业集团中心医院肿瘤内科，山东 枣庄 277800；2枣庄矿业集团枣庄医院肿瘤科，山东 枣庄 277800；3枣庄市薛城区人民医院肿瘤科，山东 枣庄 277800

肝癌是临床常见的恶性肿瘤之一，其恶性程度高且发病迅速导致病人生存率降低，目前肝癌发病机制尚未完全阐明［1］。长链非编码RNA（LncRNA）在肝癌等肿瘤组织中异常表达，并可能调控肿瘤细胞增殖、凋亡等过程从而抑制或促进肿瘤发生及发展，研究表明天然植物提取物可能通过调控LncRNA表达从而影响肝癌细胞增殖及凋亡等生物学过程［2-3］。但关于LncRNA与天然植物提取物调控的肝癌细胞增殖及凋亡过程之间的关系尚未完全阐明。肉灵芝又称太岁，其主要组成成分为多糖类、维生素、氨基酸等，研究表明肉灵芝提取物具有抗肿瘤、抗氧化等作用［4］。但肉灵芝提取物对肝癌细胞增殖及凋亡的调控机制尚未阐明。长链非编码

RNA NBR2（long non-coding RNA neighbour of BRCA1 gene 2，LncRNA NBR2）在结直肠癌中表达下调，姜黄素可通过上调LncRNA NBR2的表达而激活AMPK信号通路从而抑制结直肠癌发展进程［5］。双特异性磷酸酶4/细胞外信号调节激酶（dual specificity protein phosphatase 4/extracellular signal regulated kinase，DUSP4/ERK）信号通路激活可促进胃癌细胞增殖及侵袭，而抑制DUSP4/ERK信号通路的活化可抑制胃癌细胞增殖及侵袭［6］。但肉灵芝提取物与LncRNA NBR2/DUSP4/ERK通路在肝癌细胞增殖及凋亡过程中的调控关系尚未可知。因此，本研究拟通过检测肉灵芝提取物在抑制肝癌细胞Hep3B增殖及促进细胞凋亡过程中，LncRNA NBR2/DUSP4/ERK通路的表达变化，试图阐明LncRNA NBR2/DUSP4/ERK通路可能参与肉灵芝提取物调控的Hep3B细胞增殖及凋亡过程，为肝癌靶向治疗提供潜在靶点。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂肉灵芝提取物干粉购自吉林省白山市林源春生物科技有限公司；肝癌细胞Hep3B购自美国ATCC细胞库；MTT、细胞凋亡检测试剂盒购自美国Sigma公司；Lipofectamine2000、pcDNA3.1购自美国Invitrogen公司；si-LncRNA NBR2、si-NC购自上海吉玛制药技术有限公司；Trizol试剂购自北京索莱宝科技有限公司；反转录与荧光定量检测试剂盒购自日本TaKaRa公司；兔抗人增殖细胞核抗原（prolif-erating cell nuclear antigen，PCNA）、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved-caspase-3）抗体购自美国CST公司；兔抗人DUSP4、p-ERK抗体购自美国Santa Cruz公司；HRP标记的山羊抗兔IgG二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组肉灵芝提取物干粉（1.5 g）溶解于蒸馏水（900 mL）中，充分混匀后转移至容量瓶中（1 000 mL），定容至1 000 mL，充分混匀，制备浓度为1.5 g/L的肉灵芝提取物母液，采用0.22 μm的滤头过滤母液后密封，置于-20℃冰箱内保存，使用时进行稀释，按照一定比例稀释母液，调整药物浓度分别为1 mg/L、2 mg/L、4 mg/L［7］。Hep3B细胞生长融合度达到80%时，加入0.25%胰蛋白酶消化，传代培养。取对数生长期Hep3B细胞接种于96孔板（1×104个/孔），分别加入含有不同浓度（1 mg/L、2 mg/L、4 mg/L）的肉灵芝提取物的培养基处理24 h，分别记作1 mg/L肉灵芝提取物组、2 mg/L肉灵芝提取物组、4 mg/L肉灵芝提取物组。同时将正常培养的细胞作为NC组。后续实验设置si-NC组（si-NC转染至Hep3B细胞）、si-LncRNA NBR2组（si-LncRNA NBR2转染至Hep3B细胞）、pcDNA-NC组（pcDNANC转染至Hep3B细胞）、pcDNA-LncRNA NBR2组（pcDNA-LncRNA NBR2转染至Hep3B细胞）、肉灵芝提取物+si-NC组（si-NC转染至Hep3B细胞，加入含有浓度为4 mg/L肉灵芝提取物的培养基处理24 h）、肉灵芝提取物+si-LncRNA NBR2组（si-LncRNA NBR2转染至Hep3B细胞，加入含有浓度为4 mg/L肉灵芝提取物的培养基处理24 h）。

1.2.2 四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）检测细胞增殖取对数生长期Hep3B细胞接种至96孔板（5×103个/孔），按照“1.2.1”分组处理，加入MTT溶液（每孔20 μL），加入DMSO（每孔150 μL），应用酶标仪检测各孔在波长为490 nm处的OD值。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡率收集各组Hep3B细胞，加入预冷PBS洗涤，弃上清，收集细胞沉淀，分别加入500 μL Binding Buffer悬浮细胞，按照凋亡试剂盒说明书操作，应用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.2.4 实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（qRTPCR）检测细胞中LncRNA NBR2的表达水平采用Trizol法提取细胞总RNA，将总RNA反转录合成cDNA。以cDNA为模板进行qRT-PCR反应。LncRNA NBR2以β肌动蛋白（β-actin）为内参，采用2-ΔΔCt法计算LncRNA NBR2相对表达量。

1.2.5 蛋白质印迹法检测PCNA、Cleaved-caspase-3、DUSP4、p-ERK蛋白表达提取细胞总蛋白，检测蛋白浓度，SDS-PAGE分离蛋白，转膜、封闭，分别加入一抗稀释液（1∶1 000）与二抗稀释液（1∶2 000），室温孵育1 h，暗室内曝光显影，应用Image J软件分析各条带灰度值。

1.3 统计学方法采用SPSS 21.0统计学软件分析数据，计量资料以±s表示且均符合正态分布，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度肉灵芝提取物对Hep3B细胞增殖的影响与NC组比较，1 mg/L肉灵芝提取物组、2 mg/L肉灵芝提取物组、4 mg/L肉灵芝提取物组细胞增殖率降低（P＜0.05），PCNA蛋白水平降低（P＜0.05），选取4 mg/L肉灵芝提取物进行后续实验，见图1，表1。

图1 不同浓度肉灵芝提取物抑制Hep3B细胞PCNA蛋白相对表达

表1 不同浓度肉灵芝提取物对Hep3B细胞增殖的影响/±s

表1 不同浓度肉灵芝提取物对Hep3B细胞增殖的影响/±s

注：①与NC组比较，P＜0.05。

组别NC 1 mg/L肉灵芝提取物2 mg/L肉灵芝提取物4 mg/L肉灵芝提取物F值P值重复次数9 9 9 9 PCNA 0.91±0.09 0.75±0.07①0.55±0.05①0.32±0.04①137.04＜0.001细胞增殖率/%100.27±9.14 81.24±7.68①62.12±6.01①38.06±3.17①135.09＜0.001

2.2 肉灵芝提取物对Hep3B细胞凋亡的影响与NC组比较，肉灵芝提取物组细胞凋亡率升高（P＜0.05），Cleaved-caspase-3蛋白水平升高（P＜0.05），见图2，表2。

图2 肉灵芝提取物抑制Cleaved-caspase-3蛋白的相对表达

表2 肉灵芝提取物对Hep3B细胞凋亡的影响/±s

表2 肉灵芝提取物对Hep3B细胞凋亡的影响/±s

组别NC肉灵芝提取物t值P值重复次数9 9 Cleaved-caspase-3 0.43±0.04 0.88±0.07 16.75＜0.001凋亡率/%8.69±0.71 25.16±2.21 21.29＜0.001

2.3 肉灵芝提取物对NBR2表达的影响与NC组比较，肉灵芝提取物组LncRNA NBR2的表达水平升高［（3.46±0.31）比（1.00±0.11），t=22.44，P＜0.05］。

2.4 NBR2对Hep3B细胞增殖和凋亡的影响与si-NC组比较，si-LncRNA NBR2组细胞增殖率、PCNA蛋白水平升高（P＜0.05），凋亡率及Cleaved-caspase-3蛋白水平降低（P＜0.05）；与pcDNA-NC组比较，pcDNA-LncRNA NBR2组细胞增殖率及PCNA蛋白水平降低（P＜0.05），凋亡率及Cleaved-caspase-3蛋白水平升高（P＜0.05），见图3、表3。

表3 NBR2对Hep3B细胞增殖和凋亡的影响/±s

表3 NBR2对Hep3B细胞增殖和凋亡的影响/±s

注：①与si-NC组比较，P＜0.05。②与pcDNA-NC组比较，P＜0.05。

组别si-NC si-LncRNA NBR2 pcDNA-NC pcDNA-LncRNA NBR2 F值P值重复次数9 9 9 9 LncRNA NBR2 1.00±0.10 0.42±0.04①1.00±0.11 2.89±0.25①482.60＜0.001 PCNA 0.91±0.09 1.32±0.11①0.92±0.09 0.40±0.04②171.08＜0.001 Cleaved-caspase-3 0.46±0.04 0.19±0.02①0.48±0.05 0.83±0.08②227.45＜0.001细胞增殖率/%100.00±9.17 132.76±11.26①100.00±9.47 61.58±5.32②92.81＜0.001凋亡率/%8.51±0.72 3.89±0.31①8.63±0.73 18.16±1.71②317.87＜0.001

图3 NBR2对Hep3B细胞中PCNA、Cleaved-caspase-3蛋白相对表达量的影响

2.5 LncRNA NBR2低表达可以逆转肉灵芝提取物对Hep3B细胞增殖和凋亡的影响与肉灵芝提取物+si-NC组比较，肉灵芝提取物+si-LncRNA NBR2组细胞增殖率及PCNA蛋白水平升高（P＜0.05），凋亡率及Cleaved-caspase-3蛋白水平降低（P＜0.05），见图4，表4。

表4 NBR2低表达可以逆转肉灵芝提取物对Hep3B细胞增殖和凋亡的影响/±s

表4 NBR2低表达可以逆转肉灵芝提取物对Hep3B细胞增殖和凋亡的影响/±s

注：①与肉灵芝提取物+si-NC组比较，P＜0.05。

组别肉灵芝提取物+si-NC肉灵芝提取物+si-LncRNA NBR2 t值P值重复次数9 9 LncRNA NBR2 1.00±0.09 0.46±0.03①17.08＜0.001 PCNA 0.30±0.04 0.73±0.07①16.00＜0.001 Cleaved-caspase-3 0.86±0.08 0.50±0.05①11.45＜0.001细胞增殖率/%100.00±10.32 152.12±14.76①17.19＜0.001凋亡率/%24.96±2.11 13.07±1.05①15.14＜0.001

图4 LncRNA NBR2低表达逆转肉灵芝提取物对Hep3B细胞中PCNA、Cleaved-caspase-3蛋白的相对表达

2.6 DUSP4/ERK信号通路蛋白表达情况与NC组比较，肉灵芝提取物组DUSP4、p-ERK蛋白水平降低（P＜0.05），si-LncRNA NBR2组DUSP4、p-ERK蛋白水平升高（P＜0.05）；与肉灵芝提取物+si-NC组比较，肉灵芝提取物+si-LncRNA NBR2组DUSP4、p-ERK蛋白水平升高（P＜0.05），见图5，表5。

表5 DUSP4/ERK信号通路蛋白表达情况/±s

表5 DUSP4/ERK信号通路蛋白表达情况/±s

注：①与NC组比较，P＜0.05。②与肉灵芝提取物+si-NC组比较，P＜0.05。

组别NC肉灵芝提取物si-LncRNA NBR2肉灵芝提取物+si-NC肉灵芝提取物+si-LncRNA NBR2 F值P值重复次数9 9 9 9 9 DUSP4 0.79±0.07 0.35±0.03①1.02±0.09①0.38±0.04 0.70±0.06②189.59＜0.001 p-ERK1 0.37±0.03 0.12±0.01①0.45±0.04①0.04±0.01 0.34±0.03②382.88＜0.001 p-ERK2 0.60±0.06 0.27±0.02①0.88±0.09①0.25±0.03 0.58±0.05②199.54＜0.001 ERK1 0.42±0.04 0.40±0.04 0.39±0.03 0.41±0.04 0.38±0.03 1.71 0.168 ERK2 0.86±0.08 0.89±0.08 0.85±0.07 0.87±0.06 0.84±0.07 0.64 0.640

图5 蛋白质印迹法检测肉灵芝提取物和LncRNA NBR2对DUSP4/ERK信号通路蛋白表达情况

3 讨论

肝癌早期症状不明显导致病人确诊时已处于中晚期，而天然植物的有效成分具有抗炎、抗氧化及抗肿瘤等作用，且副作用较小，既往研究显示胡萝卜苷等中药具有抗肝癌的作用，多种中药具有多靶点、多效应等作用，但关于其作用机制尚未阐明［8-9］。

肉灵芝提取物抗肝癌的作用机制尚未阐明，本研究结果显示不同浓度的肉灵芝提取物可抑制肝癌细胞增殖，促进细胞凋亡，肉灵芝提取物处理后PCNA的表达下调，Cleaved-caspase-3的表达上调，与相关文献报道结果相似［10-11］，证实肉灵芝提取物可抑制肝癌细胞增殖及诱导细胞凋亡。

NBR2在非小细胞肺癌中表达水平降低，并可能通过调节Notch1途径而抑制非小细胞肺癌EMT进展［12］。NBR2表达上调可能通过调节Notch1信号传导而抑制骨肉瘤细胞EMT转化［13］。本研究结果显示肉灵芝提取物处理后肝癌细胞中NBR2的表达水平升高，进一步分析显示干扰NBR2表达后细胞增殖率升高，凋亡率降低，PCNA的表达水平升高，Cleaved-caspase-3的表达水平降低，而NBR2过表达后细胞增殖率降低，凋亡率升高，PCNA的表达水平降低，Cleaved-caspase-3的表达水平升高，提示肉灵芝提取物可能通过上调NBR2的表达从而发挥抗肝癌的作用。同时本研究结果显示干扰NBR2表达可逆转肉灵芝提取物对肝癌细胞增殖及凋亡的作用。ERK属于MAPKs家族成员，DUSP4属于双特异性磷酸酶家族成员，其可通过促进ERK磷酸化从而促进细胞增殖，抑制DUSP4/ERK信号通路活化可抑制肿瘤细胞增殖及侵袭［14-15］。本研究结果显示肉灵芝提取物可明显降低DUSP4、p-ERK的表达水平，干扰NBR2表达后DUSP4、p-ERK蛋白水平明显升高，而干扰NBR2表达与肉灵芝提取物共同处理后DUSP4、p-ERK蛋白水平明显升高，提示NBR2可能通过抑制DUSP4/ERK信号通路激活而发挥作用，肉灵芝提取物可通过上调NBR2表达而调控DUSP4/ERK信号通路从而影响肝癌细胞增殖及凋亡过程。

综上所述，NBR2/DUSP4/ERK通路介导肉灵芝提取物对肝癌细胞Hep3B细胞增殖的抑制作用及其对细胞凋亡的促进作用，但NBR2/DUSP4/ERK通路的具体分子机制尚需进一步阐明，NBR2可能作为肝癌治疗的潜在靶点。