纯镁超声微弧氧化—硅烷—黄芪甲苷复合处理层的细胞相容性

孙胜磊 李德超 李慕勤 戴骁焱 张慧明 彭书浩

摘 要：目的 为了调节纯镁的降解性与提高生物活性，对其表层采取超声微弧氧化（UMAO）、硅烷化、载黄芪甲苷复合处理方法，分析各种处理方法对成骨细胞生物相容性的影响大小。方法 以纯镁微弧氧化UMAO为对照组（A组），纯镁微弧氧化UMAO-硅烷（B组），纯镁微弧氧化UMAO-硅烷-100 μg/ml黄芪甲苷（C组）为实验组，通过Cell Counting Kit（CCK-8）试剂盒、扫描电镜、激光共聚焦显微镜等方式检测不同处理膜层细胞相容性。结果 CCK-8粘附与增殖实验测定的吸光率C组超过B组，B组超过A组，膜层表层细胞粘附及增殖随着时间的推移呈现出不断增加的趋势，其中纯镁微弧氧化UMAO-硅烷-100 μg/ml黄芪甲苷复合膜层具有最优的成骨细胞活性，并具有统计学意义（P>0.05）。结论 纯镁微弧氧化UMAO-硅烷-100 μg/ml黄芪甲苷复合处理后膜层的细胞相容性最好，纯镁微弧氧化UMAO-硅烷处理次之，纯镁UMAO组最低。

关键词：纯镁；超声微弧氧化；硅烷；黄芪甲苷；细胞相容性

中图分类号：R318.08 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.09.024

文章编号：1006-1959（2018）09-0079-05

Abstract：Objective To regulate the biodegradability of pure magnesium and to improve its bioactivity， ultrasound microarc oxidation （UMAO），silanization and astragaloside loading were used to treat the surface layer of magnesium，and the effects of various treatments on the biocompatibility of osteoblasts were analyzed.Methods Microarc oxidation of pure magnesium（UMAO）was used as control group（group A），magnesium microarc oxidation of UMAO- silane（group B），pure magnesium microarc oxidation UMAO- silane -100μg/ml astragaloside（group C）was the experimental group.The compatibility of different treatment membrane cells was detected by Cell Counting Kit（CCK-8）kit，scanning electron microscope and laser confocal microscope.Results The absorbance measured by CCK-8 adhesion and proliferation assays in group C surpassed group B，and group B surpassed that in group A.The adhesion and proliferation of surface layer cells in the membrane layer are increasing with time，in which pure magnesium microarc oxidation UMAO-silane-100μg/ml astragaloside composite membrane has the best osteoblast activity，and has statistical significance（P>0.05）.Conclusion After the pure magnesium microarc oxidation UMAO-silane-100μg/ml astragaloside composite treatment，the cytocompatibility of the membrane was the best，the pure magnesium micro arc oxidation UMAO-silane treatment was the second，the pure magnesium UMAO group was the lowest.

Key words：Pure magnesium；Ultrasonic microarc oxidation；Silane；Astragaloside；Cytocompatibility

純镁可作为一种良好的可以降解的医用植入金属材料，纯镁有着的降解性与良好的力学特征，具有十分关键的优势地位。近些年来，医用植入材料很大程度的采用了纯镁作为植入材料的第一选择[1-3]。在体内的生理环境中纯镁易发生降解，这种自动降解的优异性能满足了不需要二次手术将其取出，且纯镁在人体内的降解产物也没有毒副作用[4]。镁及其合金力学相容性而言也是非常优异的，能作为一些支撑的骨骼材料，或者骨钉应用于临床医学中去，为有需要的患者提供支撑；纯镁也具有非常良好的生物相容性，这使得在以纯镁作为植入材料植入到生物体内后，生物体并不会发生特别强烈的排异反应[5]。但纯镁在体内降解速率高于骨生长速率，如何降低降解速率，使之达到与骨生长匹配成为研究关键问题。微弧氧化处理，是一种通过高压利用等离子放电的阳极氧化的方法[6]。纯镁表面通过微弧氧化（MAO）技术可在纯镁表面形成严密多孔隙的薄氧化镁陶瓷层，提高纯镁表面的耐腐蚀性[7-9]。但微弧氧化表面多孔有的呈贯穿性，使体液直接浸入，发生点蚀。对硅烷采取金属预处理是近些年以来主流的表面处理方法[10]。硅烷预处理的机理其实是硅烷分子水解后生成的硅羟基与金属氧化物反应形成无机膜，使金属表面形成一种具有疏水性的膜。这种有机膜层能够保护金属基体与外界隔离，因其有机膜层的成分特点能够很好的与生物基体结合[11]。据临床和实验研究发现黄芪甲苷具有抗炎、促进骨细胞生长、降低血糖和改善心脑血管疾病等杰出的生物活性 [12]。另据实验研究显示，适宜浓度的黄芪甲苷可显著促进人体内骨髓间充质干细胞的增殖[13]。对成骨细胞进行体外培养，观察黄芪甲苷对成骨细胞增殖和分化的作用，浓度适宜的黄芪甲苷溶液对成骨细胞有促进增殖与促进分化的作用，具有促进其骨形成作用[14]。

利用纯镁的可降解性和良好的力学特性等优异特点，以控制镁的降解速率为重点，对纯镁进行微弧氧化处理，并提出硅烷中添加黄芪甲苷设计的思路。含有黄芪甲苷硅烷水解液可浸渍微弧氧化孔隙实现减少贯穿孔隙的作用，进而控制镁降解速率，而黄芪甲苷具有促进成骨细胞增殖和分化的作用，使纯镁表面形成生物性膜层。本文通过细胞毒性实验黄芪甲苷的最佳浓度，采取对比分析方法，探讨纯镁微弧氧化膜层、纯镁微弧氧化-硅烷膜层、纯镁微弧氧化-硅烷-载100 μg/ml黄芪甲苷膜层细胞膜层对成骨细胞增殖、分化及活性的影响，为纯镁及其合金在医学领域的临床应用提供充分而有说服力的依据。

1材料与方法

1.1实验材料与设备

1.1.1菌株和试剂 MC3T3-E1细胞株（中科院上海细胞库），纯镁（其中纯度超过99.9%，直径10 mm，厚1 mm），赫斯特Hoechest荧光染料（北京索莱宝），CCK8试剂盒（日本同仁），鬼笔环肽（上海祤圣生物公司），抗荧光淬灭液（Beyotime）。PBS离子缓冲液，10%胎牛血清（NQBB），胰蛋白酶（HyClone），青霉素-链霉素溶液（双抗），α-MEM培养基，硅烷，黄芪提取物黄芪甲苷。

1.1.2仪器 Air Tech净化工作台，激光共聚焦显微镜（Olympus公司），Hepa Class 100型CO2培养箱，（E）型4 ℃冰箱，YXQSG41.280型手提式压力蒸汽灭菌锅，-80 ℃冰箱，酶联免疫检测仪，AL204电子天平，SZ-100自动三重纯水蒸馏水（上海亚荣生化仪器厂），培养箱（美国Sheldom公司），扫描电子显微镜（JSM-6360LV），超声微弧氧化（UMAO）实验仪器（哈尔滨工业大学先进涂层技术实验室生产），KQ-50型医用数控超声仪（昆山超声波仪器有限司）。

1.2试件制备及分组

1.2.1镁片表面涂层制备 试件均采用厚度1 mm，直径10 mm的纯镁材料，500目、800目、1000目、1500目砂纸打磨，蒸馏水清洗晾干。将微弧氧化设备的参数设定为频率为500 Hz，脉冲宽度为50 μs，电压恒定为300 V，将纯镁试样作为正极，不锈钢电解槽为负极，将硅酸盐电解液放入超声波仪器中微弧氧化10 min，蒸馏水清洗晾干。

配制硅烷水解溶液，硅烷偶联剂KH-550∶H2O∶乙醇=1∶10∶1，将微弧氧化后试样进行硅烷封孔处理。在配制的硅烷水解液中添加100 μg/ml黄芪甲苷，配制成含黄芪甲苷硅烷水解溶液。将微弧氧化后镁试件分别悬吊于硅烷水解液和含甲苷硅烷水解溶液中，每隔30 s进行提拉一次并抛干，将上述操作重复3次后，将试件拿出快速甩干，制出复合膜层。

1.2.2实验分组 实验总共分成三个小组，纯镁微弧氧化是属于A组，即所谓的对照组；微弧氧化后载硅烷为B组；微弧氧化硅烷处理后载100 μg/ml黄芪甲苷为C组。

1.3实验方法

1.3.1细胞毒性实验 为了确定黄芪甲苷的最佳加入浓度，设置对照组（0 μg/ml）、0.1 μg/ml、1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml、1000 μg/ml黄芪甲苷培养液六组实验组，对照组为0 μg/ml的黄芪甲苷培养液，每组三个复孔。取3个96孔板分别用于3个时间点，常规培养MC3T3-E1细胞至对数期，制备细胞悬液质浓度为1×104 cells/ml，接种于各组孔板中，将三个96孔板放入培养箱中常规培养24 h后，吸出原培养液，对照组加入200 μl培养液，其余各组分别加入200 μl的0.1 μg/ml、1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml、1000 μg/ml黄芪甲苷培养液，再放入培养箱中分别培育24 h、48 h、72 h之后暂停培育，使用PBS反复清洗3次后，每孔加入100 μl无血清培养基和10 μl CCK-8溶液，其中培养4 h，在酶标仪波长为450 nm时测量A值。

1.3.2扫描电镜下观察纯镁表面和进行能谱分析 试件制造完成后，得到本实验的分组，A组、B组、C组，在试件表面进行喷金处理后，在扫描电镜下观察试件表面的微形态，并对其表面进行元素分析。

1.3.3激光共聚焦下观察细胞形态实验 将A、B、C三组样本分别放到24孔板内，细胞接种浓度为5×104 cells/ml浓度接种到三个小组材料表层，恒温培养箱主要培育12 h、24 h，0.5 ml/孔，4%的多聚甲醛37 ℃固定10 min，PBS洗2次，1 ml/次，0.5 ℃ Triton-X100 1 ml加入24孔中37 ℃，PBS 1 ml清洗2次，弃上清液，加200 μl鬼笔环肽，1 ml/次，PBS洗3次，加Hoechst 0.5 ml，常温下放置5 min，吸弃Hoechst加入PBS后，取出载玻片将试件放置其上，在试件表面加入抗荧光淬灭试剂，然后转移至显微镜观测细胞状态。

1.3.4 CCK-8细胞增殖活性检测 使用CCK-8方式观察成骨细胞增殖状况，细胞接种的方式也是一样的，各组样本中分别取12块放进24孔板中对细胞加以孵育。往往在孵育1 d、3 d、5 d之后拿出每组样本，不同时间点设定3个复孔，用PBS进行缓慢冲洗，且将其放到全新的24孔板内，根据一定比例添加培养液与CCK-8试剂，然后放进培养箱中孵育2 h之后拿出，然后吸取上清液加入96孔板里，用酶标仪观察在450 nm波长下方的OD值。

1.4统计学方法 使用SPSS20.0对整体数据加以研究，往往使用二次测量的方差分析方式，各组使用LSD的两两对比。数据以（x±s）表示，检验水平α=0.05。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2结果

2.1细胞毒性试验结果 为了确定黄芪的提取物黄芪甲苷的合适加入量，采用CCK-8实验观察MC3T3-E1成骨细胞在不同浓度黄芪甲苷处理的24 h、48 h、72 h后细胞毒性，见表1。对照组为不含黄芪甲苷的培养液，低浓度（0.1 μg/ml）组与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml组和对照组进行对比，在不同的时间差别有着统计学作用。所以，黄芪甲苷加入1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml组都能够促进成骨细胞的不断增殖，但最高浓度（1000 μg/ml）组对成骨细胞增殖有一定的约束效果。根据数据分析得出，100 μg/ml组对MC3T3-E1成骨細胞的增殖效果是最高的，因此选取100 μg/ml组作为体外细胞实验的加入量。

2.2 SEM观察试件表面形貌并进行元素分析 纯镁表层各种处理膜层SEM外形状态见图1。纯镁UMAO组表面有很多细微的小孔。然而纯镁UMAO膜层利用硅烷处理之后，B组与C组材料表层的微小孔隙明显减少，大多数孔隙均被均匀覆盖且试件表面比较平整。C组经黄芪甲苷处理之后并没有影响封孔的效果，还可以见到有白色颗粒状的黄芪甲苷粘附在表面。这表明通过不同的处理，达到了对膜层表面的封孔作用。

2.3 MC3t3-E1细胞增殖实验 表2为细胞增殖实验数值，在三个不同时间节点上，A、B、C组对比差异有统计学意义（P<0.05）。不同小组在各时间节点的差异有统计学意义（P<0.05）。在C组样本表面细胞孵育1 d、3 d、5 d之后的吸光度值达到0.719、0.831、0.954，皆显著大于B、C两组，证明C组细胞增殖情况最佳。

2.4细胞形态观察 细胞培养24 h后，通过鬼笔环肽荧光染色观察，各组细胞铺展较好，但数目差异较大，A组细胞的铺展跟数量不如B组和C组，B组与C组的细胞间没有密切的关系，C组的细胞状态更为明显，C组细胞为伸展充分，细胞之间关联紧密，相互联通，微丝骨架清晰可见，见图2。

3讨论

Correa提出，碱性清洗剂可以尽量保留镁合金外部较多的碱性羟基，这是为了和酸性硅烷羟基进行有效反应，让Si-O-Mg融合力更加强大[15，16]。因此，在实验过程中碱处理是非常关键的步骤，硅烷则起到一种“粘接剂”的作用，作为连接微弧氧化后的试件和黄芪甲苷的桥梁，将两种差异悬殊的材料连接起来，形成一种特殊的生物涂层[17，18]。目前对植入材料进行生物改性主要通过对其表面进行处理或者是将一些有生物活性的高分子材料通过某种方式固定于植入材料表面，同时在这种高分子材料固定于植入材料之后，可以保证植入界面的稳定性，因而这种材料必须有明确的目标性和指向性，可以起到与细胞、组织的中介作用[19]。微弧氧化技术有助于纯镁及其合金植入材料生物性能的提高，使纯镁及其合金的生物稳定性大大提高[20，21]。通过实验发现，纯镁表面微弧氧化后形成了多孔的生物膜层。以添加黄芪甲苷硅烷为中间层，在微弧氧化的纯镁表面，形成纯镁UMAO-硅烷-黄芪甲苷的复合生物膜层。

在今后的新型种植材料的研发与进展中，要充分考虑到种植材料在骨结合的过程中能否与骨组织的成骨细胞形成良好的生物相容性[22]。通过细胞骨架观察，黄芪甲苷涂层的表面展现出了比其他两组更好的生存能力。通过体外细胞实验，证明了载有黄芪甲苷涂层的生物涂层有着十分优良的细胞相容性。

本次实验第一次将纯镁微弧氧化、硅烷、黄芪甲苷三种处理相融合，不但加强了纯镁的生物相容性，而且将黄芪甲苷促进细胞增殖粘附的巨大优势体现出来，为今后纯镁在医学领域的应用奠定了基础，同时这些数据对种植义齿的理论总结、实际应用等各方面均具有参考价值。

4结论

纯镁经超声微弧氧化-硅烷-黄芪提取物黄芪甲苷复合处理后具有良好的细胞相容性，在体外细胞实验中表现了良好的生物相容性和生物活性，且优于纯镁UMAO和纯镁UMAO-硅烷组，纯镁UMAO-硅烷-黄芪甲苷生物膜层利于成骨细胞的增殖。

参考文献：

[1]魏方红.不同后处理对纯镁微弧氧化涂层组织结构与性能的影响[D].佳木斯大学，2015.

[2]Zeng ZR，Zhu YM，Xu SW，et al.Texture evolution during static recrystallization of cold-rolled magnesium alloys[J].Acta Materialia，2016，105（15）：479-494.

[3]王建利，马斌，张楠，等.生物可降解医用镁合金研究进展[J].热加工工艺，2015，44（10）：5-11.

[4]周俊岑.镁合金在医疗领域的应用研究[D].西南大学，2014.

[5]曲立杰.镁合金表面超声微弧氧化生物涂层的组织结构与性能[D].哈尔滨工业大学，2015.

[6]金晶.生物医用镁合金表面电沉积硅烷改性研究[D].东南大学，2016.

[7]丁文江，吴玉娟，彭立明，等.高性能镁合金研究及应用的新进展[J].中国材料进展，2010，29（8）：37-45.

[8]Barrancoa V，Carmona N，Galván JC，et al.Electrochemical study of tailored ol-gel thin films as pretreatment prior to organic coating for AZ91 magnesium alloy[J].Progress in Organic Coatings，2010，68（4）：347-355.

[9]王維仲，张晓燕，孙涛，等.硅酸盐体系中添加剂对微弧氧化陶瓷膜层的影响[J].现代机械，2010（2）：78-79.

[10]Wang BJ，Xu DK，Dong JH，et al.Effect of the crystallographic orientation and twinning on the corrosion resistance of an as-extruded Mg-3A1-1Zn（wt.%） bar[J].Scripta Materialia，2014，88（2）：5-8.

[11]冯英宁.镁合金表面硅烷化处理的研究[D].长春工业大学，2015.

[12]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2010：283-284.

[13]彭小娟，白海，王存邦，等.黄芪甲苷对人骨髓间充质干细胞体外增殖及细胞因子表达的影响[J].现代生物医学进展，2014，14（8）：1452.

[14]Guo L，Bai SP，Zhao L，et al.Astragalus polysac charide injection integr-ated with vinorelbine and cisplatin for patients with advanced non-small cell lung cancer：effects on quality of life and survival[J].Med Oncol，2012，29（3）：1656-1662.

[15]Correa PS，Malfatti CF，Azambuja DS.Corrosion behavior study of AZ91 magnesium alloy coated with methyltriethoxysilane doped with cerium ions[J].Progressin Organic Coatings，2011，72（4）：739-747.

[16]崔廷昌，赖奂汶.硅烷偶联剂研究现状[J].数码设计，2017（04）：214-220.

[17]卢国锋，乔生儒，许艳.复合材料界面层材料的研究[J].材料导报，2013，27（21）：40-43.

[18]张琪，伍林，童坤，等.硅烷偶联剂对热镀锌钢板无铬钝化液性能的影响[J].电镀与涂饰，2017（20）：1075-1080.

[19]李志安.钛种植体表面改性的现状、问题与发展趋势[J].口腔材料器械杂志，2013，22（2）：57-58.

[20]李亚娟，梁平，秦华，等.酒石酸钾钠对镁合金表面磷化膜耐蚀性的影响[J].腐蚀与防护，2013（34）：26-29.

[21]Ando D，Koike J，Sutou Y.The role of deformation twinning in the fracture behavior and mechanism of basal textured magnesium alloys[J].Materials Science&Engineering; A，2014，600（2）：145-152.

[22]趙晓鑫，马颖，孙钢.镁合金微弧氧化研究进展[J].材料保护及表面工程，2013（34）：45-47.

收稿日期：2018-2-22；修回日期：2018-3-23

编辑/杨倩