红毛藻R-藻红蛋白的提取纯化及在Cu2+检测中的应用

蔡思学，李月，王 芳，姜泽东，王 力

（1 泉州师范学院海洋与食品学院 福建泉州 362000 2 集美大学食品与生物工程学院 福建厦门 361021）

红毛藻是一种独特的可食用经济海藻，主要分布在北大西洋亚热带海区和温带海区以及北太平洋的西部和我国福建省等东南沿海地区，其味道鲜美，风味独特，含有大量不饱和脂肪酸，18 种氨基酸，丰富的膳食纤维和Ca、Mg、K 等丰富的营养元素[1-2]，并富含多糖、多酚和藻胆蛋白等多种生物活性物质。据报道红毛藻具有抗病毒[3]，抑制黑色素形成[4]，抑菌[5]，可以降低心血管疾病和慢性代谢疾病的风险[6]等作用。

藻红蛋白（PE）属于藻胆蛋白的一种，是由藻红胆素（PEB）的吡咯环与脱辅基蛋白的半胱氨酸通过硫醚键结合而成的具有荧光特性的蛋白[7]，在红藻和蓝藻中均存在，具有R-、B-、C-3 种类型，其中R-藻红蛋白主要由红毛藻产生，其含量是紫菜中含量的4～5 倍[8]。因R-藻红蛋白具有光学和光谱特性，高吸收系数和高荧光产率等特性而被视为荧光共振能量转移分析[9]、免疫分析、流式细胞术[10]和组织化学等生物技术应用中不可替代[11]。

随着工业的发展，重金属污染变得越发严重，由于重金属离子是不可生物降解的，即便是痕量也具有高毒性，并且重金属离子能在生物体内富集，威胁生态系统和人体健康，因此重金属离子污染已成为全世界瞩目的问题[12-13]。Cu2+是人体中含量第三高的过渡金属[14]，是动植物必需的微量元素，然而，它在高浓度下会对人体产生诸多不良影响，如导致肝硬化、肾损伤和阿尔茨海默病等[15-16]。迫切需要检测Cu2+含量的方法。目前检测Cu2+的方法主要有化学传感器法[17]、比色法[18-19]、电化学发光传感器法[20]、荧光探针法等，然而R-藻红蛋白作为荧光探针检测Cu2+含量鲜见报道。本文从红毛藻中提取纯化藻红蛋白，以其为荧光探针，Cu2+为猝灭剂，建立一种Cu2+含量的检测方法。

1 材料与设备

红毛藻，福建省莆田市南日镇人工养殖产品；纤维素酶 （20 000 U/g），诺维信生物有限公司；SDS-PAGE 标准蛋白，立陶宛Fermentas 公司；硫酸铵、五水硫酸铜，国药化学试剂有限公司；DEAE Sepharose FF，瑞典GE Healthcare 公司；过硫酸铵（APS）、30%丙烯酰胺，上海Sigma-Aldrich 公司；明虾、蛤蜊和金鲳鱼，均购于当地大润发超市。

Agilent Cary Eclipse 荧光分光光度计，美国Agilent 公司；Nanodrop 1000 微量蛋白核酸测定仪，美国热电Thermo 赛默飞世尔公司；LAMBDA 265 紫外-可见光分光光度计，上海PerkinElmenr仪器有限公司；Bio.Profile 凝胶成像及分析系统，法国VIbler Lourmant 公司；TS-2 脱色摇床，海门其林贝尔仪器制造有限公司。

2 试验方法

2.1 红毛藻R-藻红蛋白的提取

因R-藻红蛋白提取物在紫外吸收波长455，565 和592 nm 处有特征吸光值[21]。利用纤维素酶法[22]，称取1.0 g 红毛藻藻粉于100 mL 离心管中，加入20 mL 蒸馏水，后加入一定量的纤维素酶，混合均匀，于恒温水浴锅中酶解破壁，酶解结束后取出冷却，置于高速离心机中8 000 r/min，离心15 min，取上清液，通过紫外-可见分光光度计测定藻红蛋白浓度。并且利用正交优化试验确定酶解温度 （20，25，30，35，40 ℃），酶解时间（2，3，4，5，6 h），加酶量（0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%）作为纤维素酶解破壁的最优条件。

2.2 红毛藻R-藻红蛋白的纯化

为得到纯度较高的藻红蛋白，利用两步纯化法对红毛藻R-藻红蛋白进行纯化。首先利用硫酸铵分级沉降粗红毛藻R-藻红蛋白，在搅拌条件下缓慢向酶解后的藻红蛋白上清液加入经研磨后的硫酸铵至其饱和度为20%，4 ℃静置过夜，然后于高速离心机中 （8 000 r/min，15 min） 离心，保留20%盐析沉淀。取其分离出的上清液，同样按照上述方法向溶液中加硫酸铵至溶液的饱和度达30%，4 ℃静置过夜，离心分离上清和沉淀。重复上述操作步骤，使溶液中硫酸铵的饱和度达20%，30%，40%，50%，60%，70%。将各饱和度硫酸铵的沉降物分别溶解于0.1 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液（pH 6.8）中，后转移至截留分子质量10 ku 的透析袋中，全程避光，4 ℃条件下透析脱盐，每3 h 换1 次外液，并用电导仪检验是否透析完成。

利用DEAE Sepharose FF 二次纯化R-藻红蛋白，用AKTA 蛋白纯化系统将透析后的R-藻红蛋白液泵入已平衡后的DEAE Sepharose FF 层析柱中，用0.1 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液（pH 6.8）冲柱，洗去未吸附的藻红蛋白及杂质。待基线平衡后，使用含0.1 mol/L NaCl～0.6 mol/L NaCl 的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，线性洗脱并收集流出液，待洗脱平衡时，收集的每管流出液测定其在A565和A280的紫外吸收波长，并绘制洗脱曲线，流出液于4 ℃冰箱保存备用。

2.3 红毛藻R-藻红蛋白的鉴定

通过测定R-藻红蛋白在波长200～800 nm 范围内的紫外吸收值；测定狭缝宽度为5.0 nm，扫描200～800 nm 范围内R-藻红蛋白的荧光激发光谱与发射光谱；根据参考文献[23-24]配置SDSPAGE 电泳凝胶所需溶液并测定R-藻红蛋白分子质量以对R-藻红蛋白进行鉴定。

2.4 R-藻红蛋白对水产品中Cu2+含量的检测

2.4.1 荧光探针检测条件的优化 分别取不同pH 值（5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0）缓冲液配制不同浓度（0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6 mg/mL）R-藻红蛋白2 mL 及1 mL 浓度为1.0 μmol/L Cu2+加入10 mL 离心管中，混匀，分别于不同温度（20，25，30，35，40，45 ℃）下反应一定时间，用荧光分光光度计检测荧光强度的变化，以加1 mL 超纯水的R-藻红蛋白液为对照组，荧光强度记F0，加入1.0 μmol/L Cu2+的R-藻红蛋白为试验组，荧光强度记F，计算相对荧光强度（F0/F），研究pH、R-藻红蛋白浓度和温度对Cu2+检测效果的影响。后在R-藻红蛋白质量浓度1.2 mg/mL，Cu2+浓度1.0 μmol/L，50 mmol/L PBS 缓冲液（pH 7.0）的条件下，以不加Cu2+的R-藻红蛋白荧光探针作为空白对照，用荧光分光光度计检测体系中每隔1 min 的荧光强度变化，研究检测时间对Cu2+检测效果的影响。

2.4.2 金属干扰离子共存对Cu2+检测效果的影响在2 mL 1.2 mg/mL R-藻红蛋白中分别加入不同的干扰离子（K+、Na+、Mg2+、Ba2+、Zn2+、Fe2+、Pb2+、Al3、Ca2+）和Cu2+，按照2.4.1 节的方法进行反应，计算相对荧光强度（F0/F）的大小，研究对干扰离子存在的情况下R-藻红蛋白荧光探针对Cu2+检测效果的影响。

2.4.3 Cu2+对R-藻红蛋白的荧光淬灭 在优化条件下，测定加入不同浓度（0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，10，15，20，25，30，35，40，45，50 μmol/L）的Cu2+后R-藻红蛋白荧光探针检测体系的荧光强度（F），以不加Cu2+的R-藻红蛋白荧光强度（F0）作为空白对照，计算相对荧光强度（F0/F）。以Cu2+浓度为X 轴，相对荧光强度（F0/F）为Y轴，绘制标准曲线。

2.5 样品检测

首先进行样品的预处理，取金鲳鱼、蛤蜊的可食用部位，明虾的虾头和虾体，分别用蒸馏水洗净并沥干，-40 ℃冰箱预冷冻，转移至冻干机中冷冻干燥，粉碎过筛。后将样品粉末按照国标[25]进行前处理，并将所得样品消解液稀释15 倍，置于4 ℃冰箱冷藏备用。按照2.4.1 节中的方法进行样品中Cu2+含量的检测。

2.6 数据处理

使用正交设计助手、SPSS Statistics 17.0、Microsoft Excel 软件进行数据统计，使用Origin Pro 8.5 软件绘制图形与分析。所有试验均平行测定3次。

3 结果与分析

3.1 纤维素酶解法提取红毛藻R-藻红蛋白

通过正交试验以酶解温度（℃）、酶解时间（h）、酶添加量（%）为因素，溶解破壁后R-藻红蛋白浓度为指标，优化R-藻红蛋白的提取工艺。影响顺序为酶解温度＞酶解时间＞加酶量，其中酶解温度的影响最为显著，但是温度不可超过40 ℃否则R-藻红蛋白将不稳定分解[26]，酶解时间为5 h最优，加酶量不显著，原因可能是酶活性高，作用性强。因此纤维素酶酶解破壁的最优条件为：提取温度40 ℃，提取时间5 h，加酶量为红毛藻藻粉的2.5%，此时提取的R-藻红蛋白质量浓度为43.64 mg/mL。

3.2 R-藻红蛋白的纯化

硫酸铵饱和度对R-藻红蛋白纯化效果的影响如图1所示，硫酸铵的饱和度在10%～70%区间时，随硫酸铵饱和度的递增，R-藻红蛋白的得率和纯度均呈现先增加后降低的趋势，当硫酸铵饱和度达40%～50%时，R-藻红蛋白的得率达到最大，当硫酸铵饱和度达50%～60%时，R-藻红蛋白的纯度达到最大。为保证得到较高纯度和得率的R-藻红蛋白，试验选取饱和度为60%的硫酸铵。

图1 R-藻红蛋白盐析曲线Fig.1 Salting out curve of R-phycoerythrin

对初步纯化的R-藻红蛋白液通过DEAE Sepharose FF 柱层析进行进一步纯化处理，如图2所示，R-藻红蛋白的洗脱曲线出现3 个组分，通过测定各个洗脱峰中R-藻红蛋白在565 nm 与280 nm 处的紫外吸收值并计算其比值，可知a、c位置的R-藻红蛋白纯度低，洗脱过程首先流出的是组分a，其中包含未被吸附的R-藻红蛋白和杂质蛋白，组分c 在650 nm 处出现紫外吸收峰，此处是个别藻蓝蛋白的吸收峰，说明已有杂质被洗脱下来。组分b 处液体颜色较深，R-藻红蛋白纯度较高，R-藻红蛋白较集中，说明通过两道纯化已达到提高R-藻红蛋白纯度的目的。

图2 DEAE Sepharose FF 层析柱的洗脱组分的紫外图谱Fig.2 Spectrum of DEAE Sepharose FF chromatographic eluent

3.3 R-藻红蛋白的鉴定及表征

R-藻红蛋白紫外可见-吸收光谱由图2b 可知，R-藻红蛋白在498 nm 和565 nm 处有双峰，并在540 nm 处有一个肩峰，而620 nm 处显示的吸收峰可能是混有极少量的R-藻蓝蛋白所致。由纯度计算公式（纯度=A565/A280）可知，纯化所得R-藻红蛋白纯度为2.1，而当R-藻红蛋白纯度在0.7以下时，R-藻红蛋白属于食品级，纯度为0.7～3.9属于药品级，超过4.0 属于分析级[27]，因此本试验得到的R-藻红蛋白已达到药品级，纯度较高。

R-藻红蛋白荧光光谱如图3a 所示，R-藻红蛋白的最大发射波长位于574 nm 处，这是由于PUB 到PEB 发色团的荧光共振能量转移（FRET）[28]，与文献[29-30]基本一致。R-藻红蛋白分子质量如图3b SDS-PAGE 电泳图所示，标准蛋白marker作为对照，R-藻红蛋白条带在分子质量约为17.0，19.0，27.0 ku 左右出现3 条清晰的条带，分别对应R-藻红蛋白的α、β、γ 3 个亚基。

图3 R-藻红蛋白的鉴定及表征Fig.3 Identification and characterization of R-phycoerythrin

3.4 R-藻红蛋白对水产品中Cu2+含量的检测

3.4.1 R-藻红蛋白荧光探针检测条件的优化 pH 值对Cu2+检测效果的影响如图4a 所示，溶液pH 值在5.0～11 区间，随着pH 值的升高，相对荧光强度逐渐增大，当pH 值达到7.0 时，其相对荧光值最大，之后随pH 值的升高其相对荧光强度又逐渐减弱。说明Cu2+在pH 值为7.0 时对R-藻红蛋白的荧光猝灭程度最大，此时对Cu2+的检测效果最好。这是由于R-藻红蛋白的稳定性是通过其六聚体结构来维持的，当溶剂pH 值发生变化时，可能会导致静电性质和蛋白质缔合过程中所涉及的氢键受到干扰，导致发色团的结构发生变化，从而导致R-藻红蛋白的荧光强度降低[31]，在碱性环境中这种影响更为显著[32-33]，因此选择pH=7.0 进行接下来的试验。

R-藻红蛋白浓度对Cu2+检测效果的影响如图4b 所示，在0.4～1.6 mg/mL 的R-藻红蛋白浓度范围内，F0/F 随R-藻红蛋白浓度的增加而增大，到1.2 mg/mL 时荧光强度达到最大，之后便逐渐降低，后继续增大蛋白浓度F0/F 又有上升趋势，但仍低于1.2 mg/mL 时的相对荧光强度，这是由于R-藻红蛋白浓度达到一定程度时，体系中Cu2+含量不足以较好的猝灭R-藻红蛋白。因此，选择1.2 mg/mL 的R-藻红蛋白作为检测Cu2+的最佳浓度。

温度对Cu2+检测效果的影响如图4c 所示，水浴温度在20～35 ℃时，F0/F 增减幅度并不显著，此时温度对反应体系的影响不大，但在30 ℃时F0/F达到最大。继续提高水浴温度，可以看到F0/F 迅速持续上升，但这是由于R-藻红蛋白活性受温度影响较大，高温使R-藻红蛋白中的α-螺旋数量减少，自发解开或失去构象而变得无功能，导致色素稳定性的丧失，蛋白变性失活，导致荧光逐步减弱甚至消失所致[34]。因此，为保证R-藻红蛋白具有较高的生物活性与较好的检测效果，选择30 ℃作为检测Cu2+的最佳检测温度。

反应时间对Cu2+检测效果的影响如图4d 所示，随反应时间的延长，相对荧光强度呈线性增加，当反应超过15 min 后，曲线的变化趋于平缓，此时说明Cu2+与R-藻红蛋白作用达到平衡。为了保证R-藻红蛋白与Cu2+进行充分的相互作用，因此，体系的最佳反应时间确定为15 min。

图4 R-藻红蛋白荧光探针检测条件的优化Fig.4 Optimization of detection conditions for R-phycoerythrin fluorescent probe

3.4.2 干扰离子对Cu2+检测效果的影响 由表1可知，在相对误差在低于5%的情况下，考察了9 种与食品成分相关的干扰离子对Cu2+检测体系的影响，其中360 倍的Mg2+、270 倍的K+和Na+对R-藻红蛋白荧光探针检测Cu2+体系的荧光强度基本没有影响；6 倍的Ca2+、1.2 倍的Ba2+和Zn2+对检测体系的荧光强度影响不明显；而Fe2+、Pb2+、Al3+对检测体系的荧光强度影响较为明显。因此，在实际检测水产品的过程应减少这些共存物质对检测体系的干扰和影响。

表1 金属离子对R-PE 检测Cu2+效果的影响Table 1 The effect of metal ions on the detection of Cu2+ by R-PE

3.4.3 R-藻红蛋白荧光探针对Cu2+的检测 由图5a 可知，随Cu2+浓度的增加，该体系在574 nm 处的荧光值不断降低。图5b 为相对荧光强度（F0/F） 和Cu2+浓度间建立的标准曲线，0.5～50 μmol/L 范围内，Cu2+浓度与F0/F 呈良好的线性关系。低浓度范围（0.5～5 μmol/L），F0/F=0.1855C+0.9575，R2=0.9961；高浓度范围（5～50 μmol/L），F0/F=0.0765C+1.522，R2=0.9982，检出限分别为0.06308 μmol/L 和0.1530 μmol/L。

图5 R-藻红蛋白荧光探针对Cu2+的检测Fig.5 Detection of Cu2+ by R-phycoerythrin fluorescent probe

3.5 样品检测

为证实R-藻红蛋白荧光探针在实际样品中的适用性，将此方法应用到实际水产品中Cu2+的检测。如表2所示，R-藻红蛋白荧光探针对于实际样品中Cu2+的加标回收率为94.50%～106.03%，且RSD 值均在3%以下。因此，此方法对于实际样品的检测具有良好的适用性，可用于检测水产品中的Cu2+含量。

4 结论

利用纤维素酶解法提取红毛藻藻红蛋白，通过正交优化试验得出酶解温度、酶解时间对红毛藻藻红蛋白提取效果影响较大，提取温度为40℃，提取时间5 h，加酶量为红毛藻藻粉的2.5%时提取R-藻红蛋白质量浓度为43.64 mg/mL。通过饱和度为60%硫酸铵、DEAE Sepharose FF 柱层析两步纯化法纯化藻红蛋白，得到纯度为2.1（A620/A280） 的药品级高纯度R-藻红蛋白，此时R-藻红蛋白含有3 个亚基，α、β 和γ 亚基，分子质量分别为17.0，19.0，27.0 ku。在最佳检测条件R-藻红蛋白质量浓度1.2 mg/mL，水浴温度30 ℃，反应时间15 min，缓冲液pH 值7.0 时R-藻红蛋白荧光探针对Cu2+检测效果最好，在0.5～50 μmol/L 浓度范围内，Cu2+与F0/F 具有良好的线性关系，低浓度时F0/F =0.1855C +0.9575 （0.5 μmol/L ～5 μmol/L，R2=0.9961）；高浓度Cu2+时F0/F=0.0765C+1.522（5 μmol/L～50 μmol/L，R2=0.9982），检出限分别为0.06308 μmol/L 和0.1530 μmol/L。且该方法对实际样品的检测具有良好的适用性，回收率为94.50%～106.03%。因此R-藻红蛋白荧光探针对水产品中Cu2+检测方面具有潜在的应用价值，为水产品中重金属Cu2+检测提供了一项新的方法。