隐匿性精子症患者精液精子和睾丸精子行ICSI治疗的临床结局比较*

崔险峰，丁 攀

(天津市中心妇产科医院生殖医学中心 300100)

隐匿性精子症是指精液标本在常规显微镜检下未发现精子，而在离心后的沉淀中发现少量精子[1]。这些患者的睾丸中存在局灶性的精子发生区[2]，随着卵胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)技术的出现及发展，采用精液中极少量的精子或睾丸提取的精子行ICSI治疗，可以使这些患者拥有自己的遗传学后代[3]。然而，既往隐匿性精子症患者采用精液中精子或睾丸提取精子行ICSI对治疗结局影响的报道多存有争议[4]。因此，本研究回顾性分析了本中心此类患者的临床资料，旨在阐明在隐匿性精子症患者的辅助生殖中采用精液精子和睾丸提取精子对ICSI临床结局的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2009年3月至2020年2月在本中心接受试管婴儿治疗，且须同时满足以下7个条件的夫妇纳入本研究：(1)男方诊断为隐匿性无精子症；(2)女方诊断为女性生育力未见异常；(3)女方年龄<35周岁；(4)促排方案为促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a)长方案；(5)获得成熟卵子个数≥5个；(6)妻子取卵日，男方精液中找到足够行ICSI的活动精子，或精液中未找到精子但通过外科取精术[睾丸细针抽吸精子术/睾丸常规切开取精子术/显微睾丸切开取精术(TESA/TESE/Mic-TESE)]从睾丸中获得足够行ICSI的活动精子；(7)妻子促排取卵后即行新鲜周期移植。排除在1个周期中既采用精液精子，同时也采用睾丸提取精子的夫妇。共统计分析418例隐匿性精子症患者的ICSI结果。其中317例采用精液精子行ICSI治疗，101例采用睾丸提取精子(其中采用TESA取精8例，采用TESE取精45例，采用Mic-TESE取精48例)行ICSI治疗。本研究经本院伦理委员会审核通过，所有受试者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1精液的处理

妻子取卵日当天，隐匿性精子症患者先采用手淫体外排精，胚胎实验室收集精液标本并离心处理。具体操作：收集到的精液标本放置在37 ℃水浴箱中充分液化，将液化后的精液转入装有1.5 mL梯度离心培养液(ART-2080，美国CooperSurgical公司)的离心管,3 000×g离心20 min，弃上清液，加入1.5 mL洗精受精液(G-IVFTM PLUS，瑞典Vitrolife公司),混匀后再次3 000×g离心20 min，弃上清液，沉淀加入500 μL洗精受精液，混匀后移入培养皿中备用。若发现活精子，则采用这些精子行ICSI治疗；若未发现活精子，则安排患者第2次体外手淫取精，若取得标本处理后发现活精子，则采用这些精子行ICSI治疗；若患者第2次取得精液标本处理后未发现活精子或第2次体外手淫取精失败，则行外科睾丸取精术取精。

1.2.2睾丸精子的提取、处理及行ICSI后剩余精子的冷冻保存

1.2.2.1睾丸精子的提取

TESA：局部麻醉后以22G针头连接20 mL注射器经皮穿刺睾丸，负压吸引获得少量睾丸组织，将抽吸的睾丸组织放入盛有洗精受精液(G-IVFTM PLUS，瑞典Vitrolife公司)的培养皿中，25G注射针将睾丸组织机械割成较小的碎块，在200倍显微镜下寻找精子。TESE：局部麻醉后用小剪刀在睾丸白膜上剪开约0.3 cm小口，轻轻挤压睾丸，剪下适量睾丸组织(约5 mm×5 mm)，将切下的睾丸组织放入盛有洗精受精液(G-IVFTM PLUS，瑞典Vitrolife公司)的培养皿中，用两根25G注射针将睾丸组织机械割成较小的碎块，在200倍显微镜下寻找精子。Mic-TESE：全身麻醉后顺次切开阴囊皮肤、睾丸鞘膜，挤出睾丸，沿睾丸赤道面切开睾丸白膜(约2/3周)，掰开睾丸，在手术显微镜(放大15左右倍)下逐个睾丸小叶中寻找粗大、饱满的曲线精管，剪下曲线精管放入盛有洗精受精液(G-IVFTM PLUS，瑞典Vitrolife公司)的培养皿中，用两根25G注射针将睾丸组织机械割成较小的碎块，在200倍显微镜下寻找精子。

1.2.2.2精子的处理

TESA/TESE/Mic-TESE所获得的睾丸组织经处理镜检发现精子后，将含有睾丸组织的洗精受精液(G-IVFTM PLUS，瑞典Vitrolife公司)3 000×g离心5 min，弃上清液，留沉淀及约20 μL培养液，吹打混均，置培养箱培养3 h后用于ICSI治疗。

1.2.2.3行ICSI后剩余精子的冷冻保存

在室温下将精子冷冻液等体积成滴地加入含精子的培养液中，每加1滴要充分混匀，室温下放置10 min；将以上混合液转移到已标明夫妻姓名及编号的无菌冷冻管内封口；将冷冻管悬挂在液氮面上方30 min后，投入液氮内贮存。

1.2.3控制性卵巢刺激方案

常规采用黄体中期GnRH-a长方案进行促排周期，降调≥14 d时测定激素水平、子宫内膜厚度和窦状卵泡直径，确定达到降调标准后[(内膜厚度≤5 mm、雌二醇(E2)≤183.5 pmol/L、黄体生成素(LH)≤5 U/L、卵泡刺激素(FSH)<5 U/L、窦状卵泡直径均<8 mm]，应用150～300 IU促性腺激素(Gn)启动控制性卵巢刺激(COS)周期，并根据B超监测的卵泡情况和血清LH、E2水平调整Gn用量，当≥3个主导卵泡直径达到18 mm时，肌内注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)4 000～10 000 IU，36 h后B超引导下取卵。

1.2.4受精、胚胎移植和妊娠

按常规方法行ICSI后16～18 h观察有无原核形成，以双原核(2PN)为正常受精。分别于受精后41～43 h，61～69 h察看胚胎卵裂情况，并记录卵裂球数目。根据卵裂球大小均匀与否及核碎片量的多少进行胚胎质量评级[5]。新鲜周期胚胎移植均为第3天胚胎，移植后12 d检测血清hCG水平以确定是否妊娠，移植后30 d超声检查，见宫腔内有孕囊和心管搏动诊断为临床妊娠。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 两组患者一般资料比较

两组患者年龄、睾丸体积、血清FSH、睾酮水平、确诊到取精时间，以及配偶年龄、血清基础FSH、E2水平、基础窦状卵泡数比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；两组患者染色体异常、少数民族患者百分比比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 两组一般资料比较

2.2 COS周期中临床观察指标比较

两组患者COS周期中Gn使用量、hCG日E2水平、取得成熟卵数目、ICSI受精率、卵裂率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；两组优质胚胎形成率比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 两组受精率、卵裂率及优质胚胎形成率比较

2.3 两组新鲜周期胚胎移植情况比较

两组间行新鲜周期移植的移植胚胎数、移植优质胚胎数及移植日内膜厚度均无明显差异(P>0.05)；两组胚胎着床率、临床妊娠率和出生率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。随访胎儿和新生儿畸形，精液精子组中发现1例先天性心脏病(室间隔缺损)。

表3 两组间新鲜胚胎移植着床率、临床妊娠率和出生率比较

3 讨 论

自从1992年ICSI应用于男性不育患者，特别是严重的少弱精子症及无精子症患者以来，众多研究已证实采用精液精子、附睾精子和外科取精术获得的睾丸精子行ICSI均可使成熟卵母细胞正常受精及形成优质胚胎，并通过移植胚胎可使患者获得临床妊娠和分娩。

部分研究者认为，对隐匿性精子症患者，采用精液精子行ICSI的结局较采用提取的睾丸精子结局好，这是因为卵母细胞的体外受精率与精子成熟度密切相关[6]。正常情况下，睾丸精子生成后需要在附睾中停留一段时间，通过精子质膜通透性改变、精子核成熟及顶体外膜抗原分布的改变，最终获得运动能力及受精能力。而通过外科取精术由睾丸抽吸所获得的睾丸精子中成熟精子占比较低[7-8]，使用这样的精子会直接影响卵子激活，从而影响正常受精。但也有部分研究者提出相反的观点，认为隐匿性精子症患者行ICSI治疗时，采用睾丸提取的精子较精液精子可以取得更好的结局[4，9]。分析其可能的原因为隐匿性精子症患者精液中极少量的精子在经过泌尿生殖道时可能受污染或氧自由基损伤，而由睾丸提取的精子则不存在这些因素的影响[5，10-11]。本研究结果显示，隐匿性精子症患者行ICSI治疗时采用精液精子的受精率为60.1%，采用提取的睾丸精子的受精率为61.2%，二者无明显差异(P>0.05)，与TSAI等[12]和ESTEVES等[13]的研究结果相似。

一般认为，当受精卵分裂到4～8个细胞阶段时受精卵mRNA开始转录，提示父方基因开始表达，若精子存在缺陷，父方基因表达受阻，会导致胚胎在5～8个细胞阶段发育缓滞[14]。睾丸精子的成熟度较精液精子的成熟度低，所以部分学者认为采用睾丸精子行ICSI后的优质胚胎率低于采用精液精子[7]。但本研究结果显示，采用精液精子行ICSI后的优质胚胎形成率明显低于采用提取的睾丸精子行ICSI后的优质胚胎形成率(38.1%vs.45.2%，P<0.05)，与ALHARBI等[10]和AMBAR等[11]的研究结果相似。本研究结果还显示，采用提取的睾丸精子较精液精子行ICSI后的胚胎着床率、临床妊娠率和出生率均明显提高，与ESTEVES等[4]的研究结果相似。分析其可能的原因：睾丸提取的精子虽成熟度不及精液精子，但精子DNA损伤程度更低[11，15-17]。

本研究中行睾丸外科取精者均为在以往精液检验中(离心后)发现有活动精子，但在配偶取卵日精液中未发现精子的隐匿性精子症患者。考虑睾丸外科取精为有创操作，可能导致出血、感染及睾丸萎缩等并发症[18]，且睾丸外科取精在隐匿性精子症患者中的获精率并非100%，因此，隐匿性精子症患者行ICSI治疗时放弃精液精子而采用提取的睾丸精子仍有待进一步研究证实。对于隐匿性精子症患者在第1次采用精液精子行ICSI治疗妊娠失败后，可考虑在行第2次ICSI治疗时采用提取的睾丸精子。