4-萜稀醇对金黄色葡萄球菌的抑菌机制

连凯琪，孟祥凤，牛维东，林正丹，周玲玲，王双山，张坤朋，张明亮

(安阳工学院 生物与食品工程学院河南省兽用生物制品研发与应用国际联合实验室/河南省北艾天然产物利用与开发工程研究中心/博士后创新基地，河南 安阳 455000)

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)是人兽共患病的常见致病菌，可在临床上引起人和动物的严重感染，也是引起食物中毒的食源性细菌之一[1]。S.aureus致病性很强，有研究表明，该菌引起的细菌性感染仅次于大肠杆菌和沙门菌[2]。该菌常可引起一系列疾病，各种组织如呼吸道、胃肠道、心包和血液系统的化脓感染，严重者甚至引起人和动物死亡。此外，S.aureus容易在合适的温度条件下，可通过特定的毒素介导引起肠胃炎、休克等[1]。S.aureus还是常见的具有传染性的奶牛乳腺炎的病原体之一。据报道，近年来在奶牛乳腺炎以及母畜子宫内膜炎病例中，分离出S.aureus菌株的概率逐年增长[3-4]。

抗生素的不恰当使用导致耐药菌株不断出现，如耐甲氧西林S.aureus(MRSA)，给人和动物的安全都造成了巨大的威胁[5]。由于其严重的耐药性在临床上出现防治困难的情况，给临床用药以及治疗带来巨大的挑战[6]。近些年，这些耐药菌株的不断产生和传播给世界公共卫生带来了巨大的挑战，人们逐渐陷入面临细菌感染而无药可用的地步。所以当前抑制S.aureus的感染，减少S.aureus耐药性的产生以及开发新型抗菌药物的任务很迫切。

研究表明，一些天然产物对S.aureus具有良好的抗菌效果[7-8]。前期研究发现，北艾单体4-萜稀醇能够抑制S.aureus的生长。4-萜稀醇可从肉豆蔻、小豆蔻等中提取出来，小豆蔻的提取物4-萜稀醇有很多不同的药理作用，目前对抗肿瘤方面的报道是最常见的，此外其对消化道也有一定的维护作用，具有镇痛和镇静、抗氧化、抗炎等药理效果[9]。本试验拟通过研究4-萜稀醇对S.aureus的抗菌活性，并以此为基础来探究4-萜稀醇对S.aureus细胞膜、能量代谢等的影响，分析其抗菌机制。

1 材料与方法

1.1 菌株及主要试剂S.aureus(CMCC(B)26003)菌株，由河南省兽用生物制品研发与应用国际联合实验室保存。4-萜稀醇购自Sigma-Aldrich；刃天青、细菌DNA提取试剂盒均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；DL15000 DNA Marker购自宝生物工程(大连)有限公司；邻硝基β-D-半乳糖苷酶(ONPG)、ATP检测试剂盒购自Beytime；电镜固定液购自武汉赛维尔生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 4-萜稀醇对S.aureus最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)的测定将过夜培养的S.aureus室温4 000 r/min离心收集菌体沉淀，用无菌LB培养基将其稀释成2×106CFU/mL，用PBS将4-萜稀醇溶液稀释并乳化，按照文献[10]中的方法，检测4-萜稀醇对S.aureus的MIC。

1.3 4-萜稀醇对S.aureus的时间抑菌曲线按体积分数1∶100将过夜培养的S.aureus接种到无菌LB液体培养基中，每管5 mL，共4管，分别加入4-萜稀醇使其为0,0.5,1.0 MIC，37℃、200 r/min恒温摇床培养，依次在培养0,2,4,6,8,10,12,24 h时，每管取100 μL菌液置于入96孔测试板中，用全自动多功能酶标仪检测D600 nm处的吸光度值。

1.4 4-萜稀醇对S.aureus基因组DNA的影响将培养至对数生长期的S.aureus室温4 000 r/min离心并收集菌体，按照细菌基因组提取试剂盒说明书提取S.aureus基因组DNA，并通过超微量分光光度计测定DNA的浓度。按照4-萜稀醇与S.aureusDNA质量比分别为0,0.3,1.2,2.4,3.0,4.0,5.0设置7个组，每组DNA终质量浓度为25 μg/L，总体系20 μL，轻轻颠倒混匀溶液置于37℃恒温水浴锅中孵育30 min，然后进行核酸凝胶电泳，用核酸凝胶成像仪观察并拍照。

1.5 4-萜稀醇对S.aureus细胞膜的影响将培养至对数生长期的S.aureus室温4 000 r/min离心并收集菌体沉淀，用无菌PBS洗涤3次，重悬后分成5组，即分别加入4-萜稀醇使其终浓度为0，0.5，1.0，2.0 MIC 的4个组及0.3% Triton X-100阳性对照组，置于37℃恒温水浴锅孵育1 h，4 000 r/min离心5 min，分别取出100 μL上清置于96孔板中，加入4.5 μL终浓度为3 mmol/L的ONPG，轻轻振荡混匀，置于37℃恒温培养箱孵育30 min，用酶标仪测定D420 nm值。

1.6 4-萜稀醇对S.aureus胞内ATP的影响将培养至对数生长期的S.aureus室温4 000 r/min离心并收集菌体沉淀，用无菌PBS洗涤3次，重悬后分成4组，分别加入4-萜稀醇使其终浓度为0，0.5，1.0,2.0 MIC，置于37℃恒温水浴锅孵育1 h，4 000 r/min离心5 min，弃去上清，按照ATP检测试剂盒说明书检测菌体中ATP的浓度。

1.7 扫描电子显微镜观察4-萜稀醇对S.aureus的影响取培养至对数生长期S.aureus室温4 000 r/min离心并收集菌体，用无菌PBS溶液洗涤2次，重悬后分为2管，第1管加入终浓度为1 MIC的4-萜稀醇，第2管加入PBS作为对照组，37℃水浴1 h，室温4 000 r/min离心收集菌体，用无菌PBS溶液洗1次，加入电镜固定液重悬菌体，室温固定2 h，送武汉赛维尔生物科技有限公司进行扫描电子显微镜观察。

2 结果

2.1 4-萜稀醇对S.aureusMIC的测定用倍比稀释法测定4-萜稀醇的最小抑菌浓度，结果如图1所示，卡那霉素组完全抑制S.aureus的生长，PBS对照组都有细菌生长，第1个孔4-萜稀醇终浓度为0.127 0 mol/L，2组均在第3孔颜色变为红色，因此4-萜稀醇对S.aureus的MIC应为第2孔对应的浓度，为0.063 5 mol/L。

图1 4-萜稀醇对S.aureus的MIC

2.2 4-萜稀醇对S.aureus的时间抑菌曲线通过检测4-萜稀醇对S.aureus的抑菌曲线，评价4-萜稀醇对不同生长期S.aureus的抑菌能力。结果显示，与空白对照相比，1.0 MIC的4-萜稀醇对S.aureus杀菌作用较明显，且抑菌效果具有浓度依赖性；在24 h内，1.0 MIC的4-萜稀醇能完全抑制S.aureus的生长(图2)。

图2 4-萜稀醇对S.aureus的时间抑菌曲线

2.3 4-萜稀醇与S.aureusDNA的作用不同浓度的4-萜稀醇和S.aureusDNA在37℃恒温水浴锅中共同孵育30 min后，进行核酸凝胶电泳，结果如图3所示，随着4-萜稀醇浓度的增加，S.aureusDNA条带亮度无明显变化，说明4-萜稀醇与S.aureusDNA没有相互结合。

M.DL15000 DNA Marker;1～7.4-萜稀醇和S.aureus DNA的质量比分别为0,0.3,1.0.2.0,2.4,3.0,4.0,5.0

2.4 4-萜稀醇对S.aureus细胞膜的影响β-半乳糖苷酶是位于细菌细胞质膜上的一种水解酶，检测药物处理后的上清液中β-半乳糖苷酶的含量可以评价细胞膜的通透性，本研究也检测了不同浓度4-萜稀醇处理的S.aureus上清液中β-半乳糖苷酶的含量，结果如图4所示，4-萜稀醇导致S.aureus胞内β-半乳糖苷酶发生泄露，且呈现剂量依赖性。当用1.0 MIC 的4-萜稀醇处理S.aureus时，泄露的β-半乳糖苷酶极显著高于对照组(P<0.01)。

图4 4-萜稀醇对S.aureus胞内β-半乳糖苷酶泄露的影响

2.5 4-萜稀醇对S.aureus胞内ATP的影响ATP在细胞物质运输、能量转换中发挥重要作用，其浓度的变化直接关系到细胞的能量代谢。通过ATP检测试剂盒检测不同浓度4-萜稀醇处理的S.aureus胞内ATP浓度的变化，结果如图5所示，4-萜稀醇降低了S.aureus胞内ATP的浓度，且呈现剂量依赖性。当用0.5 MIC的4-萜稀醇处理S.aureus时，ATP的浓度极显著低于对照组(P<0.01)。

图5 4-萜稀醇对S.aureus 胞内ATP浓度的影响

2.6 扫描电子显微镜观察4-萜稀醇对S.aureus的影响扫描电子显微镜观察结果显示，对照组菌体饱满圆润、表明光滑、菌体间结合紧密(图6A，C)，而4-萜稀醇处理的S.aureus发生皱缩、表面粗糙、菌体间结合松散(图6B，D)。

A.PBS处理的对照组(×10 000)；B.1.0 MIC的4-萜稀醇处理组(×10 000)；C.PBS处理的对照组(×40 000)；D.1.0 MIC的4-萜稀醇处理组(×40 000)

3 讨论

S.aureus作为自然界中的革兰阳性菌代表，是引起细菌性感染的主要致病菌，该菌在临床上与许多疾病都有密切的联系[11]。开发新型抗S.aureus药物的任务迫在眉睫，许多中草药和单体物质是近些年研究的焦点[12-13]。与传统抗生素相比，天然产物具有来源多、较安全、抗菌范围广等特点[14]。本试验中的4-萜稀醇是一种天然产物单体，主要存在于豆蔻、艾草等植物中，属于一种食品类香料[15]。

本试验结果显示，4-萜稀醇对S.aureus的MIC为0.063 5 mol/L；1.0 MIC的4-萜稀醇至少在24 h内能够完全抑制S.aureus的生长，这表明4-萜稀醇对S.aureus具有良好的体外抗菌效果，其体内的抗菌效果需要进一步研究。

目前，揭示中药单体对S.aureus作用机制的报道相对较少，但是有一些关于抗菌肽对S.aureus作用机制的报道。钟亨任等[16]报道,Brevinin-GR23增加S.aureus细胞膜的通透性，并干扰其DNA复制发挥抗菌机制。徐令清等[17]证实,大黄及单体破坏S.aureus细胞膜，导致DNA、RNA等大分子外泄发挥抗菌作用。本研究探索了4-萜稀醇对S.aureus的作用机制。4-萜稀醇与S.aureusDNA共同孵育后的核酸凝胶电泳结果表明，4-萜稀醇与S.aureusDNA的没有相互结合。改变细胞膜的通透性是一些抗生素和抗菌肽发挥抗菌机制的重要作用方式[18-19]。因此，检测位于细胞质膜上的β-半乳糖苷酶的泄露情况常被用于评价细胞膜的通透性。一些抗菌肽和中药单体破坏了S.aureus细胞膜都导致β-半乳糖苷酶的泄露[18,20]。本试验结果表明,4-萜稀醇处理的S.aureus上清液中含有β-半乳糖苷酶，且呈现剂量依赖性，4-萜稀醇增加了S.aureus细胞膜的通透性，这与大黄单体破坏S.aureus细胞膜具有同样的作用方式。ATP是一种重要的能量代谢物质，对其进行检测常用来评价细菌或细胞能量代谢水平。刘源[21]证实，抗菌肽bacaucin-1降低S.aureus的胞内ATP导致菌体凋亡。本试验结果表明，4-萜稀醇降低了S.aureus胞内ATP浓度，也呈现剂量依赖性，这可能是4-萜稀醇影响了ATP的合成，或增加ATP的消耗，也可能是细胞膜通透性的改变导致ATP发生了泄露。扫描电子显微镜观察进一步表明4-萜稀醇可以导致S.aureus发生皱缩、表面粗糙、菌体间距增大等。

本试验结果表明，4-萜稀醇对S.aureus具有良好的抑菌活性，其主要通过改变S.aureus细胞膜的通透性、导致胞内容物外流、影响菌体能量代谢等方式发挥抑菌作用，这将为深入研究4-萜稀醇对S.aureus的抗菌机制奠定基础。