食品接触材料中化合物的非靶向筛查技术研究进展

苏启枝, 董 犇, 李 丹, 钟怀宁

（广州海关技术中心, 国家食品接触材料检测重点实验室（广东）, 广东 广州 510623）

从陶瓷、玻璃、木制品、纸、带有机涂层的金属罐到传统石油基塑料、硅橡胶及新型可降解塑料等, 不同材质的食品接触材料无处不在, 为人们的生产和生活提供了诸多便利。在食品接触材料生产过程中, 往往需要加入一定量的添加剂以提高材料的性能。常见的添加剂有：增塑剂、抗氧化剂、热稳定剂、光稳定剂和开口剂等, 这些添加剂也被称为有意添加物。另外, 食品接触材料也可能含有非人为添加的物质, 即非有意添加物, 包括原辅材料带入的杂质, 在生产、经营和使用等过程中的分解产物、污染物以及残留的反应中间产物[1］。在与食品接触的过程中, 食品接触材料中有意和非有意添加物都有可能迁移到食品中, 从而给食品安全带来额外风险。

顾名思义, 靶向筛查技术就是对某些特定物质进行测定。对于给定食品接触材料, 有些添加剂是可以预期的, 例如聚氯乙烯中的邻苯二甲酸酯、聚碳酸酯和环氧树脂中的双酚A, 这类已知或预期可能存在的物质可以通过靶向筛查技术进行监测。针对目标物性质不同, 可采用适用的分析技术, 如基于气相色谱-质谱的邻苯二甲酸酯[2-3］和环氧大豆油[4-5］的测定, 基于液相色谱荧光检测器的双酚类污染物的测定[6-7］, 基于液相色谱二极管阵列检测器的抗氧化剂、光稳定剂、邻苯二甲酸酯和光引发剂的测定[8］, 基于离子迁移谱的甲基丙烯酸甲酯的测定[9］, 基于酶联免疫吸附分析技术的邻苯二甲酸二丙酯的测定[10］, 基于液相色谱-串联质谱的光引发剂的测定[11］, 以及基于液相色谱-质谱（LC-MS）的芳香胺的测定[12］。

虽然部分非有意添加物已经为人们所熟悉, 如抗氧化剂168的氧化产物、2, 4-二叔丁基酚和壬基酚[13］, 但也有一些非有意添加物可能是未知的, 甚至是难以预测的（例如外部污染物）, 在确定物质结构之前, 难以对其进行毒理学评估。就食品接触材料的安全性而言, 仅关注有意添加物可能不够, 非靶向筛查技术为全面了解食品接触材料提供了可能。与靶向筛查不同, 非靶向筛查并无特定目标物, 其旨在尽可能多地检测和分析样品中含有的化合物。在非靶向筛查中, 由于目标物未知, 很难对样品分析方法, 包括样品前处理方法及仪器参数等进行优化。另外, 非靶向筛查技术的一个重要任务是对检出的物质进行定性分析。在食品接触材料研究领域, 气相色谱、液相色谱与质谱联用是最常用的非靶向筛查技术。得益于分离效率高、分析时间短、样品及溶剂消耗量低和操作简单等优点, 毛细管电泳技术被认为是色谱分离技术的有效替代方案, 其与质谱联用已被用于食品接触材料中有机锡和二苯甲酮型紫外吸收剂等物质的靶向筛查[14-15］, 但其在食品接触材料化合物非靶向筛查中的应用仍未见报道。核磁共振技术能够提供丰富的物质结构信息且具有分析时间短、无损分析和通量高等特性, 但灵敏度较低[16］, 在食品接触材料领域, 常用于化合物结构的确定, 特别是对于没有标准品的物质如聚酯涂层及硅胶中低聚物[17-18］的进一步确认, 而较少用于食品接触材料的非靶向筛查。在借助质谱对化合物进行鉴定时, 质谱库的使用很重要, 但质谱库的范围很有限（特别是适用于液质系统的质谱库）。在没有质谱库匹配的情况下, 化合物的定性依然是一个很大的挑战, 常常需要借助高分辨率质谱、质谱解析技术或先进的数据处理方法。

本文综述了食品接触材料中化合物的非靶向筛查技术, 总结了食品接触材料中化合物的直接提取和迁移实验两种提取方法, 介绍了应用气相色谱-质谱、液相色谱-质谱对挥发、半挥发及非挥发性物质进行定性的方法, 重点给出了非挥发性物质结构推导的流程及重要考量因素, 并分析了开放质谱库、开源数据处理工具、预测模型及与食品接触材料相关的化学结构数据库在食品接触材料组分鉴定中的潜在应用, 以期为提高食品接触材料组分特别是非有意添加物的检测分析能力提供借鉴, 从而有效提升对食品接触材料安全性的评估能力。

1 化合物提取方法

一般来说, 小分子物质如添加剂及非有意添加物均匀地分布而非通过化学键固定在基材中[19］, 通常需要将其从基材中提取出来再进行测定。如图1所示, Nerín等[20］总结了样品处理的一般方案。总的来说, 提取方法有两种：直接提取技术和迁移实验。

图1 食品接触材料样品处理的一般方案[20］Fig. 1 General scheme of sample preparation of food contact materials[20］

1.1 直接提取技术

在直接提取技术中, 热脱附结合顶空法、固相微萃取法和吹扫捕集法等可实现自动化并直接与气相色谱相连, 不需要复杂的样品前处理[20］, 方法简单便捷, 普遍应用于食品接触材料挥发性成分的检测[21-24］。然而, 此类方法主要适用于挥发性物质, 半挥发和非挥发性物质因较难释放出来, 适用性较差。

与热脱附不同, 固液萃取技术适用于不同挥发性物质。借助索氏提取[25］、微波辅助提取[26］、快速溶剂萃取[8］和超声辅助提取[27］等方法, 食品接触材料中的化合物可被如二氯甲烷、正己烷和乙腈等不同极性溶剂提取出来。除此以外, 完全溶解法也可用于塑料食品接触材料中化合物的提取。根据聚合物不同, 溶解溶剂可能不同, 如六氟异丙醇用于聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）[28］的提取, 邻二甲苯[29］或甲苯[30］用于聚烯烃, 四氢呋喃或二氯甲烷用于聚苯乙烯[31］, 氯仿用于聚碳酸酯[32］；甲醇则最常用作沉淀溶剂, 但在沉淀过程中, 部分化合物可能会被重新包裹进聚合物中, 从而导致提取效率不佳。

1.2 迁移实验

迁移实验是指根据食品接触材料实际使用情况选择合适的条件（接触时间和温度）将其直接暴露于真实食品或规定的食品模拟物中, 并分析实际迁移出来的成分。相比迁移实验, 固液萃取在相同的检测方法下通常可以检出更多组分。因此, 一种常见做法是先对材料进行固液提取, 然后对提取液进行非靶向筛查, 最后在迁移液中选择感兴趣的目标物进行定量分析[28, 33-34］。然而, 就安全性而言, 只有迁移到食品中的物质才会给消费者带来安全风险。此外, 有些物质可能会与食品模拟物或真实食品发生反应, 从而产生新物质。这些新产生的物质与消费者安全息息相关且只能通过迁移实验才能发现, 例如研究发现部分物质在水性食品模拟物中会发生水解, 产生新物质[35-36］。从这个角度来说, 建立和提高食品或食品模拟物中迁移物的非靶向筛查技术更值得关注。

国标GB 31604. 1-2015规定了迁移实验的条件和食品模拟物的选择[37］。在迁移实验后, 应选择合适的分析方法来测定食品模拟物中的迁移物。10%乙醇、20%乙醇、50%乙醇、95%乙醇和4%乙酸均可直接进行液相色谱分析, 但含水量高的样品不宜直接进入气相色谱分析。为了获得更高灵敏度或使其适用于仪器, 可对食品模拟物使用不同的萃取方法, 如顶空、固相微萃取[38］、液液萃取、液液微萃取等。对于使用真实食品进行迁移实验而言, 非靶向筛查更具有挑战性, 因为很多食品基质复杂, 如蛋白质、油脂和糖类等, 这使得样品前处理和数据分析更为困难。

2 化合物的定性

2.1 挥发性及半挥发性物质

图2显示了挥发及半挥发性物质定性的一般流程。气相色谱-质谱使用固定的电离能（70 eV）, 使得不同仪器上得到的质谱图具有高度重复性。因此, 多年来气相色谱-质谱库得到了长足的发展和广泛的应用。NIST气相色谱-质谱库包含数十万个物质的标准谱图, 被广泛用于食品接触材料成分的鉴定, 如常见的烷烃、烯烃、脂肪酸酯、增塑剂（邻苯二甲酸酯和乙酰柠檬酸三丁酯等）、抗氧化剂（BHT、抗氧化剂168和1076等）、光引发剂（二苯甲酮）和部分常见的非有意添加物（2, 4-二叔丁基酚、壬基酚和7, 9-二叔丁基-1-氧杂螺[4. 5］癸-6, 9-二烯-2, 8-二酮等）[33, 39-42］, 是食品接触材料中挥发及半挥发性污染物定性的首要选择。然而, 对于不在质谱库中的物质, 如新的非有意添加物, 对其进行准确定性仍具挑战性, 常需与软电离技术和高分辨率质谱联用, 如大气压电离气相色谱串联飞行时间质谱（APGC-QTOF MS）[43-45］。这种方法能够得到具有精确分子量的母离子和碎片离子, 从而为结构推导提供有用信息[46］, 但其通常作为普通气相色谱-质谱的补充, 很少单独用于非靶向筛查, 因为大部分物质都能够通过普通气相色谱-质谱结合质谱库进行定性, 不需要复杂耗时的结构推导。结构推导与下文中非挥发性物质的结构推导类似（“2. 2”小节）, 此处不再详细描述。

图2 挥发及半挥发性物质定性的一般流程Fig. 2 Workflow for the identification of（semi-）volatile compounds

保留时间指数（RI）法由于成本低、容易使用且不受仪器和条件的影响, 被广泛用于提高定性准确率, 降低假阳性概率。目前, NIST库中只有少部分物质有实验RI值, 大部分物质的RI值依然缺失。对于没有实验RI值的物质可以使用模型对其进行预测[47-49］, 在缺乏标准品的情况下, 如新的非有意添加物, 预测RI可以作为一个额外的参数来提高定性的准确性和可靠性[50］。

2.2 非挥发性物质

液相色谱-质谱是测定非挥发性物质最常用的技术, 可使用不同的电离源, 最常见的有电喷雾电离、大气压化学电离、大气压光电离、基质辅助激光解吸电离和直接电子电离[51］。在软电离模式下, 母离子被最大限度的保留, 为分子式的测定带来了方便；而在碰撞室中, 母离子被打碎, 产生碎片离子, 使结构推导成为可能[46, 52］。

在数据采集方面, 可分为数据依赖型（DDA）和非数据依赖型（DIA）采集。如图3A所示, 在DDA中, 只有少数高于用户设定丰度阈值的母离子被送至碰撞室中, 产生二级质谱（MS2）, 其他的离子则没有二级质谱, 从而无法进行结构推导。虽然其二级质谱背景干扰小, 但当有多个物质被共同洗脱出来时, 低丰度的母离子会被忽略, 使得覆盖范围变窄[52］。在DIA中, 一级质谱（MS1）中的所有离子都会进入碰撞室, 产生二级质谱（图3B）。其优点是覆盖范围广, 但二级质谱较复杂, 很难找到母离子和碎片离子的对应关系, 需要借助足够的解卷积算法[52-53］。

图3 数据依赖型（A）和非数据依赖型（B）采集模式的对比[52］Fig. 3 Comparison between data dependent analysis（A）and data independent analysis（B）[52］

图4显示了非挥发性物质定性的一般流程。与气相色谱-质谱图不同, 不同仪器和参数下的液相色谱-质谱图可能相差很大, 使得建立可靠、适用于所有仪器及参数的液相色谱-质谱库变得困难[54］。尽管如此, 近年来, 液相色谱-质谱库仍在不断扩大, 以期更快更准确地对非挥发性物质进行定性。其质谱图有以下两个特点：其一, 必须有母离子, 在质谱匹配时, 只有母离子相同的谱图才会被用于匹配；其二, 谱图有正负离子模式之分, 所以一般会根据正负离子模式不同使用相应的谱库。目前, NIST 2020包含超过3万个化合物, 总计132万张高分辨液相色谱-质谱图, 但由于很多仪器自带的软件并不支持直接使用这个质谱库, 故其在食品接触材料领域未能得到充分利用。一种可行的办法是使用Lib2NIST Converter软件将NIST库转成*. msp格式供其他软件如MS-DIAL使用。Metlin和mzCloud是另外两个商业液相色谱-质谱库, 其中前者曾被用于食品级多层塑料包装组分的非靶向筛查[55］, 但只有一个组分（己内酰铵）通过匹配Metlin质谱库得到鉴定, 可能是因为Metlin包含的物质大多为代谢产物而非食品接触材料相关物质。除此以外, 也有一些公开的高分辨率液相色谱-质谱库, 如MoNA、RIKEN、GNPS等[56］, 供大家下载和使用。这些谱库主要来源于代谢组学, 但也包含越来越多环境污染物, 如农药和药物, 其对食品接触材料领域的价值尚不明确, 值得进一步探索。

图4 非挥发性物质定性的一般流程Fig. 4 Workflow for the identification of nonvolatile compounds

对于未能通过质谱匹配定性的物质, 通常需要进行结构推导。结构推导的第一步是确定分子式[57］, 其前提是准确地找出母离子和相应的加合物（Adduct）。在软电离模式下, 通常一级质谱中丰度最大的离子是较为重要的母离子, 多用于分子式的确定。有时, 一个物质会同时形成多个母离子, 通过计算母离子间的精确质量差, 可以推导出每个母离子的加合物形式。在正离子模式中常见的加合物有[M+H］+、[M+Na］+、[M+NH4］+、[M+K］+、[2M+H］+、[2M+Na］+、[2M+NH4］+和[2M+K］+, 而在负离子模式下则常有[M-H］-和[2M-H］-。当一个物质可同时在正负离子模式下电离时, 则正负离子模式下母离子的质量差也可帮助推导加合物形式。通常母离子和加合物确定后, 软件可根据用户设定的元素类型、原子数量、允许质量误差和同位素误差等, 计算所有可能的分子式。如Cristina等[20］指出, 在食品接触材料中常见的元素有C、H、O、N、S, 但P、Cl、F和Br也是可能的。为了筛除在化学上不合理的分子, 可使用一些化学规则, 如双键当量、环双键当量、氮规则、LEWIS和SENIOR规则等[57］, 或结合二级质谱中的碎片模式[58-59］、启发式规则如七条金规则[60］和氢重排规则（MS-FINDER）进行筛查。

分子式确定后, 可借助一些理论电离工具（In-silico fragmentation）来推导化合物的结构, 如基于分裂规则的MS-FINDER和MassFrontier[57］或基于机器学习的SIRIUS4等。举例来说, MS-FINDER可在计算给定母离子的分子式后, 将用户选定的结构数据库中所有匹配上该分子式的化合物进行理论电离, 产生in-silico质谱图, 并与实际获得的二级质谱进行对比和打分, 从而给出可能的结构（Candidates）。通常, 可能的结构并不唯一, 而得分最高的结构也并不一定是正确的。目前, 有多种方式可以对可能的结构进行优先排序。其中, 最常用的是数据源相关规则, 即一个物质存在于与研究对象相关的数据库中, 说明这个物质可能已经在同类材料中被检出过, 而其在科学文献和专利中的被引数则在一定程度上说明了该物质的普遍性[57］。根据所研究的对象选择相关的数据库会在一定程度上减少可能结构的数量。数据源相关规则适用于已知未知物, 却无法应对未知未知物。对未知未知物而言, 通常定性难度更大, 需要结合样品信息和已检出物质等推测可能的结构, 如某些已知物的降解或反应产物, 最后可通过理论电离工具辅助判定。

上述理论电离工具中已经集成了一些结构数据库, 但大都与代谢组学相关而与食品接触材料无关。在食品接触材料领域, Groh等先后整合了两个与食品接触材料相关的数据库, 分别是塑料包装相关化合物数据库（CPPdb）[61］和食品接触用有意添加物数据库（FCCdb）[62］, 将其作为结构数据库用于结构推导可能会对食品接触材料相关组分的鉴定具有重要作用, 但目前其应用仍较少。CPPdb包含了两个综述[20, 63］中列出的非有意添加物, 但其所包含的非有意添加物的数量依然很有限, 更遑论未知的非有意添加物。值得注意的是, 文献中很多初步定性的非有意添加物大多缺乏结构信息（InChI和SMILES）, 如低聚物[28, 64-65］和在辐照下新生成的化合物[66］, 从而给结构数据库的整合带来困难。

另一种对可能结构进行排序或提高定性准确性的方法是采用与色谱保留行为相关的规则。如“2. 1”所述, 在气相色谱-质谱的结构推导中, 实验及预测保留时间指数最为常用, 但在液相色谱中, 物质在色谱中的保留行为受诸多因素影响, 如pH值、温度、缓冲盐和流动相等, 使得建立一个类似保留时间指数的数据库和建立一个通用的保留时间模型变得异常困难。尽管如此, 仍有很多研究人员致力于建立和提高适用于液相色谱的保留时间预测模型[67-71］。对非靶向筛查而言, 一些实验室可能会使用固定的仪器参数和设定。因此, 他们可以建立自己的保留时间数据库, 并在此基础上建立保留时间预测模型。Bonini等[69］建议, 为了建立较好的预测模型, 保留时间数据库至少要有300个物质的数据。

在液相色谱-质谱的基础上增加离子淌度可以区分同分异构体并生成多维度数据, 从而提高定性的准确性[72］。与保留时间不同, 通过离子淌度获得的碰撞截面积（CCS）不随实验条件的改变而改变, 可以作为额外的指标帮助化合物定性[73］。近年来, 实验CCS值的数量不断增长, CCS预测模型也被用于提高化合物的定性准确率, 如MetCCS[74］、DeepCCS[75］和AllCCS[76］。近期, Song等[77-79］发布了包含675个与食品接触材料相关的物质的CCS数据库并建立了相应的CCS预测模型, 有望进一步帮助提高食品接触材料组分定性的准确率。

3 数据处理软件

仪器自带的软件是分析相应数据的强有力工具。近年来, 受益于新颖性、开源和可重复性, 开源数据处理软件得到越来越多的关注[80］, 但在食品接触材料领域, 开源工具的使用有限, 故值得关注和尝试。不同仪器厂商的数据常常使用各自特有的数据格式, 给其他开源工具的读取带来一定困难。ProteoWizard的msConverter是最常用的数据转换工具之一[81］, 但随着开源工具的不断改进, 一些工具已经可以直接读取来自不同仪器的原始数据, 简化了数据处理流程, 提高了数据处理的效率。

质谱处理数据中的一个重要步骤是解卷积, 这是一个借助计算机来分离共洗脱组分的过程, 可为每个组分提供尽可能少干扰的质谱图, 提高定性的准确率[82］。就气相色谱-质谱数据而言, AMDIS广为人知, 也有一些开源软件可以实现类似的功能, 包括：XCMS（基于网页或R语言环境）[83］、Mzmine2[84］、MS-DIAL[85］和GNPS[86］等。这些工具整合了基于提取离子的峰检测、解卷积、峰对齐以及峰过滤等功能, 将解卷积和过滤后的质谱图导入到一些软件如NIST MS Search中进行谱图匹配即可实现定性。

XCMS、MZmine2、MS-DIAL和GNPS也可以处理液相色谱-高分辨率质谱联用的数据。相比其他平台, GNPS用户可以将数据上传到GNPS的服务器中进行分析、保存和分享, 使得读者可以直接进入到原始数据中进行查看, 甚至是再分析[87］。和气相色谱-质谱数据相比, 液相色谱-质谱数据更为复杂, 其中一个广为人知的问题是源内电离。在软电离中, 一些物质会形成多种加合物和产生源内电离碎片。在峰检测过程中, 大量的源内电离碎片和加合物会被认为是单独的离子峰, 但是它们并不一定都是独立的化合物, 而可能是同一个化合物的不同碎片或加合物。因此, 研究人员开发了一些工具来对这些离子峰进行整合, 最后只保留最重要的离子峰及其二级质谱进行定性。这些工具有CAMERA[88］、CliqueMS[89］和MS-CleanR[90］等。在进行质谱匹配后, 依然未能被定性的物质可以通过“2. 2”所述方法进一步定性。就结构推导而言, 除去仪器自带的工具, 如Waters公司的Masslynx和UNIFI、ThermoFisher的MassFrontier和Agilent的MassHunter工作站等, 也有一些开源工具被开发出来, 如MAGMa[91］、CSI：FingerID[92］、MetFrag[93］、MS-FINDER[58］、CFM-ID[94］、SIRIUS4[59］和MolDiscovery[95］。

4 结论与展望

食品接触材料的安全性越来越受到重视, 对其组分的非靶向筛查也越发重要。虽然从样品提取液中可能检测出更多的组分, 但是考虑到化合物特别是非挥发性物质定性分析的复杂性, 对迁移试样进行非靶向筛查可能更为直接有效。部分物质可能存在于食品接触材料中但并不会迁移到食品或食品模拟物中, 因此, 与消费者暴露和食品接触材料的安全无关。由于化合物的迁移量通常较低, 不易被检出, 样品浓缩、液液萃取、固相微萃取等方法可以提高对它们的检出能力。在非靶向筛查中并无固定目标物, 使得对样品处理方法、仪器参数等进行优化并不容易, 不同的实验室尚未达成共识。

质谱对于化合物的定性具有重要作用。在挥发性物质的定性中, 商业质谱库如NIST的作用无可替代；在非挥发性物质的定性中, 虽然也有商业质谱库, 但其覆盖面还很小。多个公开质谱库并非为食品接触材料领域建立, 其在该领域的作用尚不明确, 但是值得尝试和拓展。对于未能通过质谱匹配进行定性的物质, 高分辨率质谱是非常重要的工具。开源工具更新快, 紧跟学界技术前沿, 可以更多的尝试应用于食品接触材料领域, 提高数据处理的效率和准确率。加快建立与食品接触材料相关的质谱库和化学结构数据库可以加快和简化质谱数据的处理。同时, 保留时间指数和碰撞截面积预测模型的建立和应用可以提高对于这些未知物, 特别是非有意添加物的定性能力, 但是该工作依然非常具有挑战性。