气相色谱-热能分析仪法同时测定食品接触材料及制品中15种N-亚硝胺在酒精类食品模拟物中的迁移量

林 睿, 徐敦明, 黄旖珏, 董清木, 赖 莺, 杨子禾, 杨 泽, 庄丽丽, 郭思立, 吴易峰, 林伟靖, 林海霞, 丁华军, 沈露虹, 涂星朋

（厦门海关技术中心, 福建 厦门 361026）

N-亚硝胺具有肝毒性和致癌性, 为强致癌物, 是国际公认毒性较大的污染物。吸烟是人群N-亚硝胺暴露的主要途径, 对于非吸烟人群, 膳食和食品接触材料迁移则是主要暴露途径, 其它来源有内源性合成如胃中亚硝酸盐与胺的反应等。食品接触材料中亚硝胺类化合物的迁移不容忽视。以橡胶为例, 绝大多数的橡胶制品均通过高温硫化最终成型, 该过程中发生硫化反应主要是硫化剂和硫化促进剂。其中, 以仲胺为基础的硫化促进剂和硫磺给予体分解出仲胺, 并与空气或配合剂中的氮氧化合物（NOx）在酸性条件下生成稳定的N-亚硝胺类化合物。与食品接触的橡胶制品广泛用于人们的日常生活中, 如：橡胶类食品接触材料及制品、橡胶奶嘴、安抚奶嘴等。

我国及欧盟针对食品接触材料及制品中N-亚硝胺类化合物的限量主要有：HG/T 2946-2011《橡胶奶头》[1］、GB 28482-2012《婴幼儿安抚奶嘴安全要求》[2］、GB 4806. 2-2015《食品安全国家标准奶嘴》[3］、EN 12868-2017[4］, 规定奶嘴及安抚奶嘴中N-亚硝胺类化合物释放量不超过0. 01 mg/kg, N-亚硝胺可生成物释放量不超过0. 1 mg/kg；国标GB 4806. 11[5］《食品安全国家标准食品接触用橡胶材料及制品》征求意见稿, 增加了N-亚硝胺和N-亚硝胺可生成物迁移量的限量, 但尚无配套的测定方法。

目前, 测定N-亚硝胺类化合物的主要方法有气相色谱-热能分析法（GC-TEA）[2-3］、气相色谱-质谱法（GC-MS）[6-8］、气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）[9-12］、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）[13］。其中GC-TEA法具有灵敏度高（介于GC-MS法和GC-MS/MS之间）、对N-亚硝胺类化合物选择性强、基质干扰小等优点, 被欧盟、美国广泛应用于N-亚硝胺类化合物的测定。目前对食品接触材料中N-亚硝胺类化合物测定主要集中在材质及释放量的研究, 而针对迁移量的研究报道较少。由于迁移量的测定涉及酒精类食品模拟物, 存在的乙醇将导致N-亚硝胺提取困难, 本文采用GC-TEA法, 选择10%乙醇、20%乙醇和50%乙醇3种食品模拟物为研究对象, 建立了食品接触材料及制品中15种N-亚硝胺在酒精类食品模拟物中迁移量的测定方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 7890A-Ellutia 800 Series TEA（气相色谱-热能分析仪）, BUCHI Rotavapor R-300旋转蒸发仪, Milli-Q超纯水器（美国Millipore公司）, EYELA MG-2200氮吹仪（日本东京理化器械株式会社）, 电子分析天平（精度0. 01 mg）。

12种N-亚硝胺混标：N-二甲基亚硝胺（NDMA）、N-亚硝基二乙胺（NDEA）、N-亚硝基二正丙胺（NDPA）、N-亚硝基二异丁胺（NDiBA）、N-亚硝基二正丁胺（NDBA）、N-亚硝基哌啶（NPIP）、N-亚硝基吡咯烷（NPYR）、N-亚硝基吗啉（NMOR）、N-亚硝基-N-乙基苯胺（NEPhA）、N-亚硝基-N-甲基苯胺（NMPhA）、N-亚硝基-N, N-（三甲基己基）胺（NDiNA）、N-亚硝基二苄胺（NDBzA）（100μg/mL, 北京迪科马科技有限公司）, N-亚硝基-N-甲基乙胺（NMEA）、N-亚硝基二异丙胺（NDiPA）（≥98%, 上海安谱实验科技股份有限公司）；N-亚硝基二环己基胺（NDCHA, 100μg/mL, 曼哈格公司）；二氯甲烷、乙醇（色谱纯, 上海安谱实验科技股份有限公司）；其他试剂均为分析纯；实验用水为经Milli-Q净化系统制备的去离子水。椰壳活性炭固相萃取小柱（上海安谱实验科技股份有限公司）；多孔聚苯乙烯-二乙烯苯共聚物固相萃取小柱、弱阳离子交换固相萃取小柱、亲水亲脂平衡固相萃取小柱（北京迪科马科技有限公司）。

1.2 标准溶液的制备

准确称取适量的15种N-亚硝胺化合物标准品（精确至0. 01 mg）, 用乙醇配制成质量浓度约为1 000 mg/L的标准储备溶液, 逐级稀释至0. 025、0. 05、0. 1、0. 2、0. 5 mg/L系列标准工作溶液, 临用现配。

1.3 样品前处理

1.3.1 迁移试验迁移试验的条件选择及操作步骤按照GB 4806. 11[5］、GB 31406. 1-2015[14］和GB 5009. 156-2016[15］的规定。迁移试验容器选择具塞锥形瓶, 试验完成后, 手动用力摇动3～5次, 打开锥形瓶, 用镊子取出样品, 得到食品模拟物试液。若不能立即实验, 需将食品模拟物试液于4℃冰箱中避光保存。

1.3.2 N-亚硝胺化合物迁移量试液的制备食品模拟物试液冷却后, 移取40 mL试液于150 mL带聚四氟乙烯塞的分液漏斗中, 加入1. 0 mL 5 mol/L的氢氧化钠溶液, 再向分液漏斗中加入适量水和乙醇（共约60 mL）, 摇匀, 使分液漏斗内的试液中乙醇含量为20%（体积分数）。

1.3.3 提取与浓缩向“1. 3. 2”所得试液中加入二氯甲烷30 mL, 用手轻微逆时针摇晃分液漏斗, 盖上漏斗盖, 剧烈振荡15 s, 必要时放气。打开斗盖, 静置分层, 收集下层溶液, 用旋蒸瓶或K-D浓缩瓶收集, 重复提取2次, 合并提取液, 摇匀备用。

将提取液于25℃水浴温度, 真空度25 000 Pa下旋转、蒸发、浓缩至3～4 mL, 转入玻璃氮吹管中, 室温下用缓慢的氮气吹至0. 8～0. 9 mL, 无水乙醇定容至1. 0 mL, 用0. 22μm针式尼龙过滤器上机待测。

1.4 仪器条件

1.4.1 气相色谱条件色谱柱：DB-FFAP色谱柱（30 m×0. 32 mm×0. 25μm）；进样口温度：170℃；程序升温条件：初始温度60℃, 保留2 min, 以15℃/min升至82℃, 以1℃/min升至88℃, 以15℃/min升至140℃, 保留7 min, 再以15℃/min升至240℃, 保留7 min；载气：氮气（纯度≥99. 999%）；流速：1. 2 mL/min；进样方式：不分流进样；进样体积：2μL。

1.4.2 热能分析仪条件接口温度：250℃；热解室温度：500℃；真空度：59. 8～66. 5 Pa；氧气压力：13 790 Pa；臭氧水平：244（22. 8 V）。

2 结果与讨论

2.1 气相色谱条件的优化

2.1.1 气相色谱柱的确定考察了HP-5MS和极性柱（HP-INNOWax、DB-FFAP、Wonda Cap Wax色谱柱等）对目标化合物分离的影响。由于N-亚硝胺类物质均为极性化合物, 普通的HP-5MS弱极性柱分析时峰形易拖尾且重现性差。当采用HP-INNOWax柱时, 各目标化合物均能保持良好峰形, 但NEPhA与NMPhA无法实现基线分离；Wonda Cap Wax色谱柱会加速NEPhA与NMPhA降解成为乙基苯胺、甲基苯胺和一氧化氮, 导致热能检测器无法对这两种物质进行测定；采用DB-FFAP色谱柱（30 m×0. 32 mm×0. 25μm）时, 15种N-亚硝胺化合物可实现良好的基线分离（见图1）。

图1 15种N-亚硝胺化合物的色谱图（0. 25 mg/L）Fig. 1 Chromatogram of 15 N-nitrosamines（0. 25 mg/L）

2.1.2 进样口温度的确定实验发现进样口温度会对NEPhA与NMPhA的降解产生较大影响, 其产物分别为乙基苯胺和甲基苯胺。对比了进样口温度分别为150、170、190、210℃时15种N-亚硝胺的色谱图, 结果发现, 温度对NDiNA、NDCHA、NDBzA、NEPhA、NMPhA具有显著的影响, 其中NDiNA、NDCHA、NDBzA随着温度的升高, 响应值逐渐增大；NEPhA、NMPhA则随着温度的升高, 呈先上升后下降的趋势, 且以170℃时的响应值最高, 同时也能保证NDiNA、NDCHA、NDBzA的响应值满足检测需要；当温度升至210℃时, NEPhA、NMPhA已完全降解。最终将进样口温度设为170℃。

2.2 前处理条件的优化

N-亚硝胺类物质为路易斯碱, 将浸泡液调为碱性能有效降低N-亚硝胺类化合物在模拟液中的溶解度, 并增加其稳定性, 提升提取效率。综合考虑N-亚硝胺类物质在不同溶剂中的溶解能力、溶剂与水溶液的相溶性、试剂的毒性等方面, 同时参考GB 28482-2012和EN 12868-2017的测定方法, 最后确认二氯甲烷作为提取溶剂, 既能保证提取效率, 又不会对实验员和大气环境造成太大污染。

由于阳性样品不易获得, 本文通过对空白实际样品（天然橡胶片）的迁移试验试液加标, 对前处理条件进行优化。浸泡方式为：每60 dm2食品接触材料及制品接触1 kg食品模拟物比例浸泡, 各种液态食品的密度以1 kg/L计。分别准确移取空白食品模拟物试液40 mL（10%乙醇、20%乙醇、50%乙醇）于150 mL分液漏斗中, 加入1. 0 mL 5. 0 mol/L的氢氧化钠溶液, 再加入0. 5 mL 1 mg/L的N-亚硝胺化合物混合标准溶液, 混合均匀, 使食品模拟物中N-亚硝胺的质量浓度为12. 5μg/L（相当于迁移量为12. 5μg/kg）。

2.2.1 萃取次数的优化分别以90 mL二氯甲烷提取1次、45 mL二氯甲烷提取2次、30 mL二氯甲烷提取3次, 考察了提取次数对15种N-亚硝胺类化合物回收率的影响。结果表明, 当提取次数为1次时, 3种模拟物的回收率普遍较低；当提取次数为2次时, 10%和20%乙醇的回收率提升至70%～80%；提取次数为3次时, 20%乙醇的回收率均大于90%；10%乙醇, 除NDMA回收率略低外, 其余化合物的回收率均与20%乙醇相近；50%乙醇的回收率为64. 8%～88. 0%。造成上述回收率差异的主要原因为：①N-亚硝胺易溶于乙醇, 而乙醇会阻碍二氯甲烷对目标物的提取。②随着食品模拟物中乙醇含量的提高, 提取液中乙醇的含量增加。当提取液中乙醇含量过少时, 后期浓缩过程易受人为或仪器设备因素的影响, 造成提取液浓缩过度, 低沸点N-亚硝胺化合物（特别是NDMA）损失；当提取液中乙醇含量过多时, 会造成后期旋转蒸发及氮吹浓缩的时间大幅增加, 也会导致低沸点N-亚硝胺的挥发, 回收率下降。为保证N-亚硝胺类化合物提取完全, 本文采用30 mL二氯甲烷提取3次, 并以20%乙醇食品模拟物为研究对象, 对前处理条件进行优化。

2.2.2 旋转蒸发条件的优化在真空度为30 000 Pa下, 考察了不同水浴温度（25、30、40、50、60℃）对15种N-亚硝胺类化合物回收率的影响, 结果表明：25℃时的整体回收率与30℃相近, 均大于90. 0%；水浴温度对NDMA产生较大影响, 当水浴温度大于40℃时, 水浴温度越高, NDMA的回收率越低。由于二氯甲烷沸点为39. 8℃、易挥发, 温度越高, 提取液越易爆沸, 进而污染仪器设备, 影响回收率。综合考虑实验耗时、安全性及回收率影响, 选择水浴温度为25℃。

在25℃水浴温度下, 进一步考察了不同真空度（25 000、30 000、6 000 Pa）对15种N-亚硝胺类化合物回收率的影响, 结果表明：25 000 Pa和30 000 Pa的回收率无显著差异, 回收率均大于90. 0%, 但25 000 Pa可以进一步缩短试验时间；而用6 000 Pa直接减压旋蒸至1 mL, 则时间延长, 且回收率降低（总体回收率为56. 0%～76. 8%）。综合考虑回收率及时间, 本文选择旋转蒸发真空度为25 000 Pa。

2.2.3 振荡时间的优化考察了不同振荡时间（15、30、45、60、120 s）对15种N-亚硝胺类化合物回收率的影响。结果表明, 剧烈振荡15 s时, 15种N-亚硝胺类化合物的回收率接近100%, 随着振荡时间延长, 回收率无明显变化。综合考虑操作时间和回收率, 本文将提取时间设为15 s。

2.2.4 氮吹条件的优化参照GB 28482-2012, 在室温下调节氮气流速, 确保浓缩表面形成的凹陷不超过2～3 mm（防止液体飞溅）, 考察了不同氮吹浓缩体积（近干、0. 4～0. 6 mL、0. 8～0. 9 mL）对回收率的影响（图2）。结果表明：当氮吹至近干或0. 4～0. 6 mL时, 会造成低沸点N-亚硝胺类化合物的回收率降低, 特别是NDMA；氮吹至0. 8～0. 9 mL时, 15种N-亚硝胺类化合物的回收率为95. 2%～101%。因此, 本文将氮吹浓缩条件定为室温氮吹至0. 8～0. 9 mL。

图2 氮吹浓缩体积对回收率的影响Fig. 2 Influence of nitrogen blowing concentration volume on recovery

2.2.5 提取液中乙醇含量的优化由于50%乙醇食品模拟物的提取液中乙醇含量高, 导致浓缩时间长、回收率偏低, 因此需降低乙醇含量以确保N-亚硝胺回收率。通常降低提取液中乙醇含量的方法有直接蒸馏法、反渗透膜技术、稀释法。

50%乙醇的沸点约82℃, 采用直接蒸馏法的蒸馏时间较长, 会导致低沸点的N-亚硝胺挥发, 造成损失；利用反渗透膜法需要大型的设备, 不适合日常检测。由于前期已经对20%乙醇模拟物进行了研究, 发现具有浓缩时间适中、回收率高、重复性好等优点。因此, 本文用水将50%乙醇稀释至20%乙醇后, 考察对N-亚硝胺回收率的影响。结果表明：经稀释后50%乙醇提取液的浓缩时间缩短至原来的1/4, 且15种N-亚硝胺类化合物的回收率均大于90. 0%。

由于本文涉及多种食品模拟物, 为了确保方法统一, 本文将N-亚硝胺类化合物迁移量试液的制备确定为：食品模拟物试液冷却后, 移取40 mL于150 mL带聚四氟乙烯塞的分液漏斗中, 加入1. 0 mL 5 mol/L氢氧化钠溶液, 再向分液漏斗中加入适量水和乙醇（合计约60 mL）, 摇匀, 使分液漏斗内试液中乙醇的体积分数为20%。

2.3 固相萃取法与液液萃取法的比较

目前, 固相萃取法常用于水样中N-亚硝胺类化合物的测定, 但存在NDMA回收率偏低的缺点。本文考察了椰壳活性炭固相萃取小柱、多孔聚苯乙烯-二乙烯苯共聚物固相萃取小柱、弱阳离子交换固相萃取小柱、亲水亲脂平衡固相萃取小柱对水及50%乙醇模拟物中15种N-亚硝胺类化合物回收率的影响。结果表明：上述4类固相萃取柱对水中的15种N-亚硝胺类化合物保留较好, 回收率为71. 2%～102%, 但对50%乙醇中的N-亚硝胺类化合物保留差, 回收率为4. 02%～93. 6%。造成上述结果的原因是：上述四种固相萃取柱主要通过反相作用力吸附化合物, 当上样溶液乙醇含量增大时, 洗脱能力增强, 化合物保留能力降低, 造成回收率偏低。

通过比较, 上文优化的液液萃取法的回收率远高于固相萃取法, 因此, 本文将液液萃取法确定为酒精类食品模拟物中N-亚硝胺类化合物的提取方法。

2.4 线性关系、检出限与定量下限

对“1. 2”系列标准溶液进行分析, 以峰面积（y）为纵坐标, 对应的质量浓度（x, mg/L）为横坐标绘制标准曲线。结果表明, 15种N-亚硝胺均在0. 025～0. 5 mg/L范围内线性良好, 相关系数（r2）为0. 998 4～0. 999 9。本文以响应最低的物质为基准, 确定方法的检出限（LOD, S/N≥3）为0. 200μg/kg, 定量下限（LOQ, S/N≥10）为0. 625μg/kg。方法的灵敏度满足GB 4806. 11-修订版中对N-亚硝胺迁移量的限量要求（SML=0. 01 mg/kg）。

2.5 准确度与精密度

选取天然橡胶片空白样品, 添加不同浓度的混合标准溶液, 制成含量分别为0. 625、1. 25、6. 25 μg/kg的加标样品, 每个样品按前处理方法提取并平行测定6次, 计算得到15种N-亚硝胺类化合物的加标回收率及相对标准偏差（见表1）。结果表明, 15种N-亚硝胺类化合物的平均回收率为85. 7%～106%, 相对标准偏差（RSD）小于10%, 方法的准确度与精密度完全满足分析要求。

表1 天然橡胶片中15种N-亚硝胺类化合物的平均加标回收率及相对标准偏差（n=6）Table 1 Spiked recoveries and relative standard deviations of 15 N-nitrosamines in natural rubber sheet（n=6）

2.6 实际样品的检测

选择天然乳胶片、TRP汤勺、TPU片等共13份样品, 按照“1. 3. 1”对实际样品进行迁移实验, 得到模拟物试液后, 按本方法进行检测, 结果显示样品均为阴性。

3 结 论

本文采用液液萃取作为前处理方法, 结合气相色谱-热能分析仪同时测定食品接触材料及制品中15种N-亚硝胺在酒精类食品模拟物中的迁移量, 解决了N-亚硝胺类化合物在酒精类食品模拟物提取难的技术难题, 并应用该方法对实际样品进行测定。该方法操作简便、定量准确、回收率高、灵敏度高、重现性好, 弥补了GB 4806. 11-修订版检测方法的空白, 满足实际检测需求。