水性涂料中半挥发性化合物的非靶向筛查及其潜在危害评估

马洪生, 杨青华, 林勤保, 颜凌燕, 魏晓芬, 王 玥

（1. 珠海红塔仁恒包装股份有限公司, 广东 珠海 519070；2. 暨南大学 包装工程研究所, 广东 珠海 519070）

自然纤维基纸和纸板材料及其制品能够重复使用, 对环境影响较低, 而且纸包装材料在食品供应链中能够起到优良的包装作用, 比如纸杯、纸碗等制品。传统聚乙烯（PE）可通过淋膜工艺为纸制品提供更加优良的耐水耐油性能, 因此淋膜纸和纸杯广泛应用于水、饮料等液体食品接触材料[1-2］。而研究表明, 淋膜纸杯在90℃左右的热水浸泡下, 会释放出微塑料颗粒、重金属等危害物质[3］, 可能产生潜在的安全风险。随着可持续发展理念的深入和塑料污染治理的加强, PE涂层对环境的潜在影响同样不可忽视。团体标准框架T/CPA 001-2021中介绍了一种水性涂层纸和纸杯, 该类纸制品具有可生物降解、回收再制浆等环境友好的优势, 并能够提供合适的耐水耐油和阻隔性, 同时《团体标准食品接触用环保型涂布纸和纸板材料及制品》也处于公开征求意见阶段, 食品接触用水性涂层纸逐渐成为受到关注的新型食品接触用纸[4］。

食品接触用纸中存在超过六千多种物质可能迁移到食品中, 其中有意添加物（IAS）主要来源于各种功能性改性助剂, 而印刷油墨、粘合剂、涂层等加工原料, 以及生产过程中的污染物等可能引入非有意添加物（NIAS）[5-6］, 如邻苯二甲酸酯、光引发剂等68种重点关注的污染物均能从食品接触用纸和纸板材料中检出[7］。而水性涂料借助多种聚合单体在引发剂和添加助剂的作用下, 发生乳液聚合作用从而形成聚合物涂层。前期研究表明, 水性涂料中的挥发性和半挥发性成分比较复杂, 这意味着水性涂料中的IAS和NIAS可能成为迁移到食品中的物质, 带来食品安全隐患[8］。因此, 非靶向筛查水性涂料中的IAS和NIAS, 并对其潜在毒性风险进行预测评估, 显得尤为重要。

本研究利用气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术对3种自然干燥水性涂料中的半挥发性化合物进行非靶向筛查, 结合MS-DIAL软件、保留指数和NIST质谱库进行定性分析, 并通过对部分结构相似化合物的半定量分析以及利用T. E. S. T软件和VEGA QSAR软件对不同毒性终点进行预测, 以评估物质的潜在毒性危害。

1 实验部分

1.1 试剂与样品

标准品：2-乙基己醇（纯度99. 5%, 上海腾准生物科技有限公司）；二乙二醇二丁醚（纯度99%）、2, 4-二叔丁基苯酚（纯度98%）、甲基丙烯酸2-乙基己酯（纯度99%）购于上海迈瑞尔化学技术有限公司；丙烯酸-2-乙基己酯（2-EHA, 纯度＞99%）、邻苯二甲酸二辛酯（纯度99%）购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；苯乙烯（纯度99. 5%）、甲醇（色谱纯）购于上海麦克林生化科技有限公司；1 000 mg/L正构烷烃（C7～C40）混合标准溶液（色谱纯, 上海安谱璀世标准技术服务有限公司）。

样品：3种水性涂料样品（编号为S1～S3）, 由珠海红塔仁恒包装股份有限公司提供。

1.2 仪器与设备

Agilent 7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪（美国安捷伦有限公司）；石英毛细管色谱柱DB-5MS（30 m×0. 25 mm×0. 25μm, 安捷伦科技有限公司）；TLE204E电子天平（准确等级I, 上海梅特勒-托利多有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 标准工作溶液配制标准储备溶液：分别准确称量0. 025 g各标准品（精确至0. 01 mg）于25 mL棕色容量瓶中, 用甲醇稀释定容至刻度, 配制成质量浓度约为1 000 mg/L的混合标准储备溶液, 置于4℃保存。标准工作溶液：分别用甲醇将混合标准储备溶液逐级稀释成一系列不同质量浓度的混合标准工作溶液。

1.3.2 样品前处理分别准确称量0. 50 g（精确至0. 01 g）水性涂料样品于试管中, 自然放置干燥, 并记录质量直至恒重, 样品S1、S2、S3的固体含量分别为51. 67%、40. 55%和41. 85%。分别加入10 mL甲醇于各试管中, 超声萃取30 min, 取清液过有机系尼龙微孔滤膜, 待GC-MS分析。

1.3.3 色谱与质谱条件GC条件：色谱柱：Agilent DB-5MS（30 m×0. 25 mm×0. 25μm）；溶剂延迟3 min。升温程序：初始柱温60℃, 以5℃/min升至150℃, 保持2 min；再以10℃/min升至300℃, 保持2 min。载气（He, 纯度＞99. 999%）, 流速为1 mL/min, 进样量为1μL, 不分流进样。

MS条件：电子轰击（EI）离子源, 电离能量为70 eV, 离子源温度为230℃；传输线温度为275℃；全扫描（SCAN）模式, 扫描质量范围为m/z 40～800；选择离子（SIM）模式。

1.4 数据处理

通过MS-DIAL version 4. 90代谢组学软件[9］对3种水性涂料样品中的半挥发性化合物进行非靶向筛查, 通过保留指数、NIST质谱库匹配提高物质定性的准确性[8］。其中, 软件参数设置如下：离子化类型选择“Hard ionization（GC/MS）”, 数据类型为“Centriod data”, 导入. CDF格式数据文件、. txt正构烷烃（C9～C27）保留时间文件和. msp质谱库, 并设置样品相关类型；MS质量数分析范围为40～800 Da, 容差值为0. 5 Da, 最小分析峰高为2 000, 保留指数相似度容差为20%, 保留时间容差为0. 5 min, EI碎片离子峰的相似度不低于80%。为增加定性准确性, 分别人工检查MS-DIAL峰对齐结果（综合得分）和GCMS工作站中NIST MS search检索结果（EI相似度、频率）, 筛选并手动注释准确的定性物质信息。

为确定检出物质的用途和功能, 以及后续毒性预测评估, 分别在物质限制清单、法规和相关数据库, 如Pubchem（https：//pubchem. ncbi. nlm. nih. gov）数据库、高度关注物质清单（SVHC）、REACH清单（https：//echa. europa. eu/home）、有害空气污染物（HAPs）、特定迁移限量（SML）等[10-11］, 检索定性物质的信息, 包括CAS号（或NIST#）、SMILES等。利用Origin 2021和IBM SPSS Statistics 25进行相应图形绘制和数据处理分析。

2 结果与讨论

2.1 方法学验证

2.1.1 线性方程与检出限采用本方法对7种目标化合物的系列混合标准工作溶液进行测定, 分别以目标物的质量浓度（X）为横坐标, 峰面积（Y）为纵坐标, 拟合线性回归方程。由表1可知, 目标物在不同质量浓度范围内具有良好的线性关系, 相关系数（r2）均不低于0. 974 7。分别以基线平均噪音的3倍和10倍对应的目标物质量浓度作为方法检出限（LOD）和定量下限（LOQ）, 结果显示, 除响应较低的二乙二醇二丁醚外, 其余6种化合物的检出限为0. 29～42. 86μg/L, 定量下限为0. 97～142. 86μg/L, 基本满足定量检测的灵敏度要求。

表1 目标物质的线性关系、检出限及定量下限Table 1 Linear relations, LODs and LOQs for targeted analytes

2.1.2 加标回收率与相对标准偏差采用甲醇分别配制低、中、高3个不同浓度水平的目标物质标准溶液, 并按照与样品相同的超声提取条件处理后, 测定目标物质浓度, 计算回收率和相对标准偏差（RSD）, 以验证方法的准确度和精密度, 每个加标浓度平行测定6次。由表2可知, 目标物质在3个加标水平下的平均回收率为85. 2%～118%, RSD为1. 3%～11%, 表明该方法基本满足定量分析要求。

表2 目标物质的加标回收率及相对标准偏差（n=6）Table 2 Recoveries and RSDs of targeted analytes（n=6）

2.2 水性涂料中半挥发性物质的初步识别

利用甲醇超声提取自然干燥至恒重的水性涂料样品中的半挥发性化合物, 其总离子流图（TIC）如图1所示。由图可知, 相较于样品S2和S3, S1的物质组成更复杂, 在20 min后S1中出现更多的色谱特征峰, 而在20 min前, 3种样品的特征峰均较少, 可检出2-乙基己醇、丙烯酸-2-乙基己酯、甲基丙烯酸-2-乙基己酯等部分物质。

图1 3种涂料样品（S1、S2和S3）中半挥发性化合物的总离子流图Fig. 1 Total ion chromatograms（TIC）of semi-volatile organic compounds extracted from three coating samples（S1, S2 and S3）

通过MS-DIAL峰对齐处理将部分重叠峰进行解卷积, 3种涂料样品和空白溶剂中共检出139个色谱特征峰（峰高大于2 000）, 借助保留指数匹配和NIST MS search分析, 可初步定性出仅来自于涂料样品中的63种半挥发性化合物。参考NIST MS search软件对化合物识别分类, 可将上述物质分为7种芳香烃化合物、9种羰基化合物、13种酯基化合物、6种碳氢化合物、9种羟基化合物以及19种具有多种官能团或无明确分类的其他化合物。其中, 3种涂料样品中各类化合物的分布情况如图2A所示, 除了羟基化合物, 样品S1中其余几种化合物的数量均较多, 且这些化合物的总峰面积（图2B）与数量表现出相同的规律, 可说明样品S1中物质更加复杂。

图2 3种涂层样品（S1、S2、S3）中化合物的类别分布（A）及其总峰面积（B）Fig. 2 Classes distribution（A）and total peak area（B）of chemicals from three coating samples（S1, S2 and S3）

样品S1中检出的芳香烃类物质主要为苯乙烯和α-甲基苯乙烯（即2-苯丙烯）, 平均相对峰面积分别为1. 02%和1. 84%, 而在样品S2中两者的相对峰面积略高, 分别为2. 67%和1. 88%。由图2B可知, 样品S1中芳香烃化合物的总峰面积更高, 其中苯乙烯和α-甲基苯乙烯的峰面积比样品S2中的更高, 而这两种物质在样品S3中未检出。从Pubchem数据库可知, 苯乙烯和α-甲基苯乙烯在多种食品接触材料中被检出, 同时在涂料中还能作为丙烯酸酯类乳液涂料的共聚单体, 替代部分丙烯酸酯类单体的作用, 降低涂料粘度并形成涂层[12］, 说明苯乙烯和α-甲基苯乙烯可能作为乳液类涂料样品中的有意添加聚合单体物质。

醛类、酮类和羧酸类化合物被归类为羰基化合物, 样品S1中羰基化合物的总峰面积远高于其他样品。其中, 苯乙酮常用于花香特征的风味物质, 同时还能作为光敏剂。软脂酸可用于制造棕榈酸盐, 而棕榈酸金属盐（如钠盐）可在水性乳液涂料中起到乳化剂、表面活性剂的作用, 该物质未在样品S3中检出。

含有酯基结构的化合物在样品S1中的相对总峰面积为34. 68%, 其中, 丙烯酸-2-乙基己酯、丙烯酸异辛酯和甲基丙烯酸-2-乙基己酯, 可能是作为丙烯酸酯乳液的聚合单体；在样品S2和S3中也主要检出了甲基丙烯酸-2-乙基己酯、丙烯酸异辛酯等单体物质, 推测上述3种涂料样品是水性丙烯酸酯乳液型涂料, 这与前期的研究发现相同[8］。此外, 样品中检测到不同峰面积的邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二辛酯2种增塑剂, 尽管邻苯二甲酸二丁酯可起到消泡作用, 增加乳液流平性能, 但该类物质已被列入SVHC清单并受到REACH管控限制, 其潜在安全性不容忽视。棕榈酸甲酯和硬酯酸甲酯对3种涂料样品中酯基结构化合物的检出均起到主要贡献作用, 是常见表面活性剂生产的中间体。此外, 间苯二甲酸二甲酯等酯类物质仅在样品S1中检测到。

而在羟基化合物中主要包括醇类物质和酚羟基结构物质, 如2-乙基己醇、月桂醇、十四醇以及2, 4-二叔丁基苯酚等。样品S1中2-乙基己醇的峰面积最大, 2-乙基己醇是具有愉悦花草香的风味剂, 可能来源于醇类溶剂残留, 或是干燥涂膜中丙烯酸-2-乙基己酯或甲基丙烯酸-2-乙基己酯聚合单体的断裂产物。此外, 2, 4-二叔丁基苯酚的相对峰面积占样品S1中化合物相对峰面积的6. 06%, 该物质常用于合成紫外吸收剂、增塑剂等。2, 2'-亚甲基双-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）是食品接触材料中常检出的添加剂, 其在上述3种涂料样品中均可检出, 在乳液或粘合剂中起到抗氧化、稳定的作用。值得注意的是, 仅在样品S2中检出的月桂醇、十四醇和十六醇, 能用于有机合成乳化剂、消泡剂等表面活性剂, 例如月桂醇硫酸钠（SDS）是用于乳液涂料的阴离子表面活性剂。2-乙基己醇、月桂醇等物质则可能是水性涂料中重要的NIAS。此外, 2, 4, 7, 9-四甲基-5-癸炔-4, 7-二醇是常用于涂料的炔烃类表面活性剂, 三乙二醇单丁醚能够用作部分添加剂的助溶剂, 并能与水溶液互溶形成水性体系, 这两种物质均只在样品S3中检出。

2.3 半挥发性物质的潜在危害评估

对部分具有准确结构和相似结构的物质进行准确定量或半定量分析, 并基于两种构效关系（SAR）工具, T. E. S. T软件（https：//www. epa. gov/chemical-research/toxicity-estimation-software-tool-test）和VEGA QSAR（https：//www. vega-qsar. eu/）软件, 对非靶向筛查物质的不同毒性终点进行预测评估, 包括急性毒性、发育毒性、致癌致突变性等[13-14］。

使用T. E. S. T软件和共识预测法可对各化合物的发育毒性、致突变性和小鼠半数致死量（LD50）进行预测。共识法能够对分层法、单模型法等方法的预测结果求取平均值, 从而实现更好的预测可信度, 用于预测评估物质毒性[15］；利用VEGA QSAR软件对上述毒性终点进行预测分析, 将物质的不同毒性终点预测结果进行分类描述。此外, 还利用VEGA QSAR软件对致癌性、Cramer等级进行分析。基于物质毒性和结构间的假设关系, 可通过Cramer决策树将化合物分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3类, 对应的毒理学关注阈值（TTC）分别为30、9、1. 5μg/kg bw/d。

对于发育毒性和致突变性等级分类, 将在两种软件中预测为共识阳性结果的物质标记为ClassⅠ, 均为阴性的物质标记为ClassⅢ, 其余预测情况为ClassⅡ；而对于LD50, 将两种软件中预测致死剂量均大于5 000 mg/kg的物质标记为ClassⅢ, 将任一软件预测致死剂量小于500 mg/kg的物质标记为ClassⅠ, 其余预测情况均为ClassⅡ。

由63种半挥发性化合物的危害评估结果（如图3）可知, 两种软件预测均具有发育毒性、致突变和LD50阳性的化合物数量分别为21、11和4种, 说明这些物质的预测结果更加准确且潜在风险较高（图3A）。其中, 含有Cl、N和Si等元素的化合物, 均具有阳性的致癌致突变作用和发育毒性, 如氯代十二烷、秋水仙胺、硅氧烷等。其中硅氧烷可能是来源于聚丙烯酸乳液中的改性剂, 而其他物质主要是NIAS或存在错判可能的物质。其中, 大部分物质（43种）不具有致突变阳性作用。由图3B可知, 26种化合物被归类为CramerⅢ, 对应的毒理学关注阈值TTC=1. 5μg/kg bw/d, 这些化合物同样包括含有Cl、N和Si元素的物质, 以及一些含有苯环等结构的物质。由图3C可知, 28种物质表现为致癌阳性, 主要包括烃类物质和部分醇类物质。

图3 3种涂料样品中63种半挥发性化合物的危害预测评估结果Fig. 3 Potential hazard assessment results of 63 semi-volatile compounds from three coating samples

对某些具有相似结构或具体功能用途的物质进行（半）定量分析（表3）。其中, 2, 4-二叔丁基苯酚、2-甲基-1-萘酚、2, 2'-亚甲基双-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）和2-乙基己醇等物质表现出发育毒性, 可能对人类发育产生不良影响。2-乙基己醇可能来源于丙烯酸酯类单体的断链过程, 该物质所规定的特定迁移限量为30 mg/kg, 而其在3种涂料样品中均具有较高的含量, 特别是在样品S1中含量达707. 37 mg/kg。除了间苯二甲酸二甲酯表现出发育毒性阳性, 样品中大部分酯类化合物的毒性风险不高。常见丙烯酸酯类单体被规定特定迁移总限量不得超过6 mg/kg, 其中丙烯酸-2-乙基己酯的特定迁移限量不能超过0. 05 mg/kg, 而在研究样品中丙烯酸酯类物质作为有意添加的聚合单体物质, 检出含量较高, 如丙烯酸-2-乙基己酯在样品S1中的含量最高为150. 87 mg/kg。当用于食品接触时, 很有可能迁移到食品中。此外, 仅在样品S1和S2中检测到的苯乙烯和α-甲基苯乙烯, 表现出致突变阳性和致癌阳性, 苯乙烯还被列为HAPs物质清单, 即有害空气污染物, 对人体具有一定刺激作用, 甚至引起不适症状。目前暂无明确规定苯乙烯作为非有意添加物质的迁移限量要求, 而α-甲基苯乙烯被规定特定迁移量不得超过0. 05 mg/kg。此外, 样品S3中三乙二醇单丁醚的检出含量较高, 为1 616. 28 mg/kg, 其预测结果仅表现为致癌阳性。其他可能作为IAS的物质, 如表面活性剂2, 4, 7, 9-四甲基-5-癸炔-4, 7-二醇、月桂醇等, 其部分毒性端点的预测风险较低。

表3 3种样品中可量化物质的含量及其毒性危害评估Table 3 Contents and toxic hazard assessment of some quantifiable substances in three samples

（续表3）

（续表3）

3 结 论

本文通过GC-MS对3种水性涂料样品中的半挥发性化合物进行非靶向筛查后, 利用MS-DIAL软件结合保留指数和NIST质谱库定性, 初步得到包括芳香烃化合物、羰基化合物、酯基化合物以及具有多种官能团的63种化合物。3种涂料样品中作为有意添加的聚合单体主要为丙烯酸-2-乙基己酯、甲基丙烯酸-2-乙基己酯和丙烯酸异辛酯, 并检出不同含量的苯乙烯、α-甲基苯乙烯共聚单体、2, 4, 7, 9-四甲基-5-癸炔-4, 7-二醇消泡剂和三乙二醇单丁醚助溶剂等有意添加物质。对部分相似结构的化合物进行半定量分析, 并利用T. E. S. T和VEGA QSAR软件进行潜在的毒性风险预测评估。部分含有Cl、N、Si元素的化合物, 以及绝大多数非有意添加物质, 如2-乙基己醇、间苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二辛酯等, 在不同毒性终点预测结果中表现为发育毒性、致癌致突变阳性或较低毒理学关注阈值, 而除了苯乙烯和α-甲基苯乙烯之外, 丙烯酸酯类聚合单体和某些添加助剂等IAS, 并未表现出毒性阳性风险。基于以上分析, 今后应进一步评估水性涂层中迁移物的安全风险, 为水性涂层纸的食品接触使用提供参考依据。