中草药复配农药对茎瘤芥黑斑病菌的抑制效果

邢立刚，邹 峰，梁 静，张灿峰，李泽舟，罗大刚，梅 刚，马 磊，周群文

[1.长江师范学院现代农业与生物工程学院，重庆涪陵 408000；2.重庆中邦药业（集团）有限公司，重庆涪陵408000]

黑斑病是乌头、冬青、蔷薇、甜菜等植物的普通病害，由多种真菌所致，包括假单胞属（Pseudomonas）细菌及多腔菌属（Asterina）、星盾炱属（Asterinella）、小星盾炱属（Asteroma）、星壳孢属（Diplotheca）、小丛壳属（Glomerella）、日规壳属（Gnomonia）、裂盾菌属（Microthyriella）、扁壳黴属（Placosphaeria）、疵黴属（Stigmea）等真菌。茎瘤芥黑斑病是由半知菌亚门链格孢属芸薹链格孢侵染引起[1]，它对茎瘤芥的侵染一般发生在潮湿季节[2]，可能发生在叶或茎部，症状为出现圆形或不规则形黑色斑片状病损，病斑随着病害的持续而逐渐加深并且出现凹陷，最终形成黑色硬质斑块，严重影响茎瘤芥的生长[3]。病害发展到后期严重时，会出现多个病斑连结成一块大的病斑。在有机农药出现以前，我国常使用的农药有植物源农药及无机农药，只是在有机农药出现以后，有机农药快速占据主导地位，因为有机农药对病虫害的防治效果要远强于植物源农药和无机农药[4]，虽然防治效果好，但会带来环境污染、生态平衡破坏和食品安全等一系列问题，因此在开发低毒有机农药的同时，具有安全、有效、无污染等优点的植物源农药重新回归人们的视野[5-7]。自然界中蕴藏大约50 万种的植物资源[8]，许多植物具有抑菌成分，可按照不同比例复配形成植物源抑菌剂，已广泛用于农产品的生产贮藏。植物农药与有机农药各有优缺点，植物农药有安全、无污染等优点，但其防治效果远不如有机农药；而有机农药则相反，防治效果好，但有环境污染、不安全等缺点。通过对不同复配比例及浓度进行试验[9-10]，筛选出效果好、污染低、更加安全的农药[11]。

1 材料与方法

1.1 试验材料及设备

本试验从重庆市涪陵区义和街道采集茎瘤芥的黑斑病标本，在PDA 培养基上用常规组织分离法获得纯培养。参试中药包括猫爪草、白头翁、千年健、五指毛桃、蝉花、蛇床子、蒙古蒿、穿心莲、豨莶草、宽筋藤、鸭脚艾、草豆蔻、灯心草、柚核、麻黄，分别购于桐君阁大药房和广州采芝林国医馆有限公司北商大药房，对照农药为25%多菌灵。

恒温摇床培养箱（ZHWY-2102C），高温数显陶瓷电热板（C-MAG HP 7），自动压力蒸汽灭菌器（GI54DWS），电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9245A）。

1.2 试验方法

1.2.1 PDA培养基制备

称取200 g 土豆加入足量超纯水，煮至土豆酥软且水量小于500 mL，各称取20 g 葡萄糖、琼脂，加超纯水至500 mL，制成两倍浓度PDA培养基，再分装入2 个锥形瓶，其中1 瓶加250 mL 超纯水制成正常的PDA 培养基。吸取10 mL 两倍浓度PDA 培养基于6 支试管中，取培养皿，同时将6 支试管及200 mL 超纯水一同灭菌，115 ℃下灭菌30 min[12-13]。取出后置于水浴锅中，90 ℃保温。空试管和培养皿灭菌烘干备用。

1.2.2 真菌复苏

取出水浴锅中正常PDA 培养基置于超净工作台，倒平板，取出茎瘤芥黑斑病真菌的菌液置于超净工作台，吸取50 μL 菌液加入平板中，涂均匀后封口，放入25 ℃恒温摇床培养箱中培养，培养结束后，下次接取菌饼备用。

1.2.3 中药提取液的制备

每种中药称取30 g，加入适量超纯水，浸泡30 min，进行熬制，待煮沸开始计时，熬制20 min 后倒入大烧杯，共熬制3 次，用4 层纱布过滤[14]，继续浓缩至30 mL，放入4 ℃冰箱备用[15]。

1.2.4 单味中药与复方中药的抑菌试验

将试管和培养皿置于超净工作台，吸取中药液和灭菌水加入试管中，制成浓度为0.2、0.6、1.0 g·mL-1的药液10 mL，塞上棉塞取出进行90 ℃水浴加热。将两倍浓度PDA 培养基的试管取出，放入恒温水浴锅，取出2支装培养基的试管和2支装药液的试管，75%酒精消毒后移入超净工作台，倒入培养皿之中混匀。冷却后，切取5 mm的菌饼，向药基中接入菌饼，用封口膜进行封口[16]。取出，置于恒温培养箱，25 ℃倒置培养[17]。在培养结束时，采用十字交叉法测量菌落直径[18]。

待中药筛选完毕，通过前面单味中药试验结果制出复方中药，按照比例称取药材，加水熬制浓缩成1 g·mL-1的中药提取液，制成0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1 g·mL-1的药基[19]，向培养基中接入菌饼，封口，置于25 ℃恒温培养箱倒置培养[20]，待培养结束，取出测量菌落直径，拍照。

1.2.5 农药的抑菌试验

在超净工作台中，向试管中加入1 g 多菌灵粉剂，加入超纯水至10 mL，吸取1 mL 药液加入另一支试管中，再加入超纯水至10 mL，进行梯度稀释[21]，稀释成0.1 mg·mL-1的稀释液，取出PDA 培养基加热融化，先将多菌灵稀释液加入平皿，再将培养基加入，混匀制成1、2、4、6、8、10 μg·mL-1的20 mL 多菌灵药基。待多菌灵药基冷却，切取菌饼接入药基，方法同上。

1.2.6 复方中药与农药复配的抑菌试验

以1 g·mL-1的中药配方药液与0.1 g·mL-1的多菌灵药液为原液，按照1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1的比例制成25 组不同比例的药基，置于超净工作台中，将中药液按照每个药基所需要的量加入试管，取出进行水浴加热保温。在平皿上加入不同量的农药溶液，取出灭菌的培养基，水浴保温，同时取出中药液和培养基加入含有农药的培养皿，混匀，药基制作完成。接入菌饼培养，培养结束后，对其菌落直径进行测量、拍照。

2 结果与分析

2.1 单味中药及复方中药对黑斑病真菌的抑制效果

2.1.1 单味中药的抑菌率

由表1可见，千年健、白头翁、猫爪草在0.3 g·mL-1浓度下，黑斑病真菌菌丝不再生长，抑菌率达到100%；五指毛桃、蝉花在0.5 g·mL-1浓度下抑菌率达到100%；蛇床子、穿心莲在0.5 g·mL-1浓度下抑菌率最大，在80%～90%；宽筋藤、豨莶草、鸭脚艾在0.5 g·mL-1浓度下抑菌率最大，在70%～80%；柚核、麻黄、灯心草在0.5 g·mL-1浓度下抑菌率最大，但低于60%。在李鹏祥的研究中，发现藿香的水提物、醇提物对人参黑斑病菌的抑制效果相差极大，在浓度0.01 g·mL-1时抑菌率分别为34.9%、88.2%[22]。提取方式不同，同一种药材提取物的抑菌效果也不相同[23]，所以试验可能存在部分药材因提取方式不恰当导致的抑菌效果不佳[24]。

表1 单味中药对茎瘤芥黑斑病菌的抑制率 单位：%

2.1.2 复方中药的抑菌率

由表2可见，复方中药浓度达0.2 g·mL-1时，对茎瘤芥黑斑病菌的抑制率已达100%；随着复方药浓度的降低，抑菌率也在下降，在0.2 g·mL-1浓度及以上的抑菌率均为100%。

表2 复方中药对茎瘤芥黑斑病菌的抑制率

2.2 农药对黑斑病真菌的抑制

25%多菌灵浓度为2 μg·mL-1时，其抑菌率为100%，表明多菌灵对茎瘤芥黑斑病真菌具有极强的抑菌效果；多菌灵浓度为1 μg·mL-1时，抑菌率为93.1%。在马荣等关于红枣黑斑病菌的杀菌剂研究中，发现75%百菌清等杀菌剂的EC50均高于1 μg·mL-1，其中40%氟硅唑、50%喹啉铜的EC50值低于1 μg·mL-1，其浓度达到1 μg·mL-1时抑菌效果远低于90%[25]。25%多菌灵制成培养基对茎瘤芥黑斑病菌的抑制效果极强，需要稀释浓度，应远低于说明书上的浓度，可能是室内毒力与大田防治的差别，也可能是初次使用多菌灵，菌种对多菌灵的抗性极低的原因。

2.3 中药配方与农药复配对黑斑病真菌的抑制

在参考高小宽等关于农药与三七复配的研究基础上[26]，这里我们将多菌灵浓度0.0005 mg·mL-1与复方中药浓度50 mg·mL-1分别为定义为最大浓度1∶1，复配比例如表3。结果表明，配比为3∶1 时，抑菌率最大为88.24%；配比为1∶3 时，抑菌率最大为85.29%；配比为2∶1 时，抑菌率最大为79.41%；配比为1∶2时，抑菌率最大为73.53%；配比为1∶1 时，抑菌率最大为65.88%；5 组配比中抑菌效果最好的是3∶1，最差的是1∶1，抑菌率随着多菌灵浓度降低而下降得更快，复方中药与农药复配的抑菌效果下降。

表3 复方中药与多菌灵不同复配比例下的抑菌率

3 小结与讨论

通过单味中药的抑菌试验，发现抑菌效果最好的有千年健、白头翁、猫爪草3种，在0.3 g·mL-1浓度时对茎瘤芥黑斑病真菌的抑菌率已达到100%；五指毛桃稍差，浓度0.3 g·mL-1时的抑菌率为88%，五指毛桃与蝉花在浓度0.5 g·mL-1时达到了100%的抑菌率；蛇床子、穿心莲次之，在浓度0.5 g·mL-1时对黑斑病真菌同样有很强的抑制效果，抑菌率达到80%以上；鸭脚艾、豨莶草、宽筋藤对茎瘤芥黑斑病真菌有较强的抑制效果，抑菌率在70%～80%；灯心草、麻黄、柚核，抑菌效果最差，在药物浓度0.5 g·mL-1时的抑菌率不足50%。单独使用猫爪草、白头翁时，药剂浓度从0.1 g·mL-1升到0.3 g·mL-1，其抑菌率出现跳跃式增长，可能与朱华旭等研究一样，在用水煎和浓缩过程中出现沉淀，制作药基时吸取上层清液，未摇晃混匀，且药物浓度低，药液中抑菌活性物质减少，使得抑菌效果不佳[27]。用25%多菌灵可湿性粉剂制作的药物培养基对茎瘤芥黑斑病真菌表现出极强的抑制效果，在浓度为1 μg·mL-1时抑菌率达93.1%，药物浓度比之中药要低很多，但就如石志琦等认为的一样，多菌灵作用的靶标真菌容易产生抗药性，从而导致防治失败[28]。复方中药的抑菌效果比单味中药效果要好，可能是各种中药之间存在相互增益，使得抑菌效果增强很多，在药物浓度为0.1 g·mL-1时抑菌率就高达96%。复方中药和多菌灵复配所得的抑菌率比预期要差，复配的抑菌率还不如相同浓度下单独使用时的抑菌率。

综上所述，针对本试验所选的中药，可继续进行单味中药抑菌制剂的研究，也可从中药毒性和降低农药残留两个方面考虑，通过降低药物浓度，研究复方中药和农药的复配比例，达到减毒增效复配农药的效果。试验结果可对茎瘤芥黑斑病复配中药农药、降低化学农药残留与污染的研究提供依据，为进一步研究奠定基础。