地黄饮子对阿尔茨海默病模型小鼠海马组织氧化应激及炎性因子表达的影响

宋志勇，穆亚敏 (湘潭医卫职业技术学院，湖南 湘潭 411104)

阿尔茨海默病(AD)是常见的神经系统退行性疾病，好发于老年人群，以认知障碍、记忆障碍为主要临床表现，对患者的生存质量以及家庭和社会带来严重影响。迄今为止，AD发病机制尚未完全阐明，仍然缺乏理想的治疗手段和药物[1-2]。随着研究深入，免疫炎性反应和氧化应激学在AD发病机制的作用日益受到重视，对开发具有抗炎、抗氧化等多途径作用特点的中药复方，在防治AD方面将极具优势和前景[3-5]。遵循中医辨证理念组成的地黄饮子具有补肾阳、滋肾阴及化痰开窍等作用，在多项研究中已取得较好的临床疗效[6-7]。但地黄饮子对氧化应激及炎性因子的影响暂不清楚，鉴于此，本实验旨在揭示地黄饮子对AD模型小鼠海马组织氧化应激及炎性因子表达的影响，为阐明地黄饮子的治疗机制提供依据。

1 资料与方法

1.1实验材料：3个月月龄SPF级PP/PS1双转基因雄性小鼠作为AD模型动物50只，体重在30～40 g之间，地黄饮子(校附属医院药剂科提供)，吡拉西坦(石药集团欧意药业有限公司，国药准字H13021787)。白细胞介素(IL)-6、IL-1、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，超敏C-反应蛋白(hs-CRP)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(北京北方生物科技有限公司)。超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒，谷胱甘肽过氧化物(GSH-Px)，过氧化氢酶(CAT)，丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。Morris水迷宫及视频分析系统(众实迪创)，离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司)，酶标仪(美国 BIO-RAD公司 ) 电热恒温培养箱(上海齐欣科学仪器有限公司)及相关手术器械等。本次研究经过我院医学伦理委员会审查同意。

1.2方法

1.2.1分组及给药方法：将50只AD小鼠随机分为安慰组(等体积的蒸馏水)、地黄饮子低剂量组(生药量为0.8 g/kg)、地黄饮子中剂量组(生药量为1.6 g/kg)、地黄饮子汤高剂量组(生药量为3.2 g/kg)、脑复康(吡拉西坦)组(0.63 g/kg)。10只/组，1次/d，持续4 w。地黄饮子方剂组成：肉苁蓉9g、巴戟天9 g、熟地黄10 g、山茱萸9 g、附子6 g、肉桂6 g、麦冬6 g、石斛9 g、五味子6 g、远志6 g、石菖蒲6 g、茯苓6 g、薄荷5 g、生姜9 g、大枣15 g。按照人和动物体表面积折算的等效剂量比率表换算高、中、低剂量。分别相当于60 kg成人临床用量等效量的23.3倍、5.8倍，医院煎药房按照要求煎煮成生药含量为3.456 g/ml、1.728 g/ml。

1.2.2指标检测：①应用Morris水迷宫试验连续观察各组AD小鼠在第1周、第2周、第3周、第4周的认知功能变化，具体操作方法：练小鼠在一个直径为80 cm的水池寻找到水下的隐藏平台。实验共4 d，小鼠分别从四个象限面朝池壁放入水池，60 s内找到平台的时间记录为逃避潜伏期[8]。②炎性因子水平测定:小鼠行为学实验结束后，禁食24 h，断头法处死，准确称取海马组织后按照1∶9加入预冷至4℃的生理盐水，匀浆后取上清，分装、冻存。采用ELISA测定各组小鼠脑组织IL-1、IL-6、TNF-α以及hs-CRP含量。操作过程严格按照试剂盒说明书方法。试剂盒加样200 μl/孔，37℃水浴2 h，加入羊抗小鼠IgG HRP，37℃水浴1 h，加入TMB显色液，避光震荡孵育15 min显色后加终止液，于490 nm处波长记录读数。③氧化应激水平测定:另取小鼠海马组织，制成匀浆，采用ELISA法测定SOD、GSH-Px、CAT以及MDA含量，严格按照试剂盒说明书方法进行操作。

2 结果

2.1各组小鼠学习记忆能力比较:与安慰组比较，地黄饮子低、中、高剂量各组及脑复康组逃避潜伏期时间在治疗1 w、2 w、3 w、4 w后均逐渐缩短(P<0.05)，且地黄饮子低、中、高剂量组呈剂量效应关系(P<0.05)。地黄饮子组高剂量组逃避潜伏期时间明显低于脑复康组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组小鼠学习记忆能力比较

2.2各组小鼠炎性因子水平比较:与安慰组相比，地黄饮子低、中、高剂量各组海马组织IL-1、IL-6、TNF-α以及hs-CRP水平呈剂量效应的下降(P<0.05)，且地黄饮子高剂量组明显低于脑复康组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组小鼠炎性因子水平比较

2.3各组小鼠氧化应激指标比较:与安慰组相比，地黄饮子低、中、高剂量各组SOD、GSH-Px以及CAT水平呈剂量效应的增加(P<0.05)，MDA呈现剂量效应的降低(P<0.05)，且地黄饮子高剂量组与脑复康组呈显著性差异(P<0.05)。见表3。

表3 各组小鼠氧化应激指标比较

3 讨论

AD是以认知能力减退为主要特征的老年性痴呆，β-淀粉样蛋白(Aβ)被认为是AD发病的中心环节，Aβ42聚集导致炎性反应和氧化损伤，最终导致神经元凋亡和痴呆[8]。迄今为止，尚缺乏有效的治疗药物和手段，AD属于中医“痴呆”范畴，既往有学者对中医药治疗AD进行了大量的研究[9]。基本病机为肾精亏虚，痰瘀阻络，因此治疗AD应以补肾填精兼化瘀祛痰为治法。

地黄饮子原名地黄饮，始载于金元四大家之首刘完素的《黄帝素问宣明方》，在原方基础上加薄荷，增加大枣、生姜调和营卫的作用，进而增强了滋阴肾、补肾阳及开窍化痰的功效。既往研究显示地黄饮子在AD治疗方面具有突出优势[10-11]。但在治疗机制上尚有许多未解之谜。故本研究从炎性反应和氧化损伤这两类机制探讨地黄饮子的药理效应。本研究首先应用Morris水迷宫试验评价了地黄饮子三种剂量对空间记忆能力的影响，并用脑复康作为参照药物，结果显示，随着地黄饮子剂量增加，高剂量在第4周的潜伏期最短，且优于脑复康组，表明高剂量地黄饮子可以明显改善模型小鼠的空间记忆能力。接下来本文对各组炎性因子水平进行了检测，结果发现地黄饮子低、中、高剂量各组海马组织IL-1、IL-6、TNF-α以及hs-CRP水平呈剂量效应下降，且高剂量地黄饮子下降效果最好。表明高剂量地黄饮子可以明显改善模型小鼠海马组织的炎性因子水平，减轻炎性反应。IL-1、IL-6和TNF-α是重要的促炎细胞因子，可以介导中枢神经系统免疫应答和炎性反应，可诱导急性相反应蛋白在神经炎性斑块中聚集，也可激活补体损伤神经细胞[12-13]。hs-CRP是一种敏感的非特异性炎性标志物，但目前就其在AD中的含量变化尚未有定论[14]。提示抗炎是地黄饮子下改善模型小鼠学习记忆能力的作用机制之一。氧化应激发生于AD 疾病进程的早期，氧化应激学说在AD 的发生发展中起举足轻重的作用。SOD、CAT和GSH-Px是天然存在的氧自由基清除剂，其活性的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力。MDA是脂质过氧化的主要降解产物，具有细胞毒性，其含量的多少间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度[15]。本研究结果显示高剂量组OD、CAT和GSH-Px含量增加最为明显，MDA减少最为明显，可见高剂量地黄饮子具有强大机体清除氧自由基的能力，通过改善氧化应激实现改善学习记忆能力。

综上所述，高剂量地黄饮子可改善AD 模型小鼠的空间记忆能力，其机制可能与降低脑组织氧化应激水平及炎症因子表达有关。