侵染小构树的双生病毒及其缺陷DNA形式的检测和特征分析

孔卫青，杨金宏，凌君，楚渠，孟刚

(安康学院陕西省蚕桑重点实验室，陕西 安康 725000)

双生病毒是世界范围内具有严重危害的单链环状DNA病毒，可以侵染多种经济作物，通常以叶蝉、粉虱、蚜虫、角蝉等昆虫为介体进行传播[1]。双生病毒基因组结构有单组分和双组分两种。单组分结构双生病毒的基因组由一个环状单链DNA(single-stranded DNA，ssDNA)组成，可编码4～7个开放阅读框，其中病毒链主要编码外壳蛋白(coat protein，CP)和移动蛋白(movement protein，MP)，互补链上主要编码复制相关蛋白(replication-related protein A，RepA)及其剪接体Rep。病毒链和互补链的ORF之间由大小间隔区(large/small intergenic region，LIR/SIR)隔开[1]。双组分双生病毒的基因组由两个环状ssDNA(DNA-A和DNA-B)组成，仅存在于菜豆金黄花叶病毒属(Begomovirus)[2]，其中DNA-A组分的病毒链主要编码CP蛋白、互补链编码Rep，DNA-B组分主要编码MP蛋白，具有双生病毒复制和转录需要的茎环结构及保守的顶端序列。另外，双生病毒还往往存在伴随分子，如缺陷DNA(defective DNA，D-DNA)，其由双组分双生病毒的DNA-B组分或单组分双生病毒的DNA-A缺失引起，有部分Rep基因和完整的IR区，有些含未知来源序列的插入甚至新的ORF[3]。D-DNA可以影响辅助病毒的正常活动，进而使病毒病症状减轻，因此可以此发展新的抗病策略[4]。

小构树(Broussonetia kazinoki)是蔷薇目桑科构属植物，木质素含量低，是优质的造纸原料。小构树还可做药用，果实及根皮有补肾利尿、强筋骨的功效，韧皮部汁液可治癣疮及蛇虫兽等的咬伤。由小构树作母本培育得到的杂交构树，叶片肥厚，蛋白含量高，能代替奶牛精饲料生产使用的苜蓿草。近年来，在秦岭腹地发现较多的小构树出现叶片黄化现象。据Qiu等[5]的研究表明，构树卷叶病毒(Paper mulberry leaf curl virus 1and2，PMLCV-1和PMLCV-2)可引起构树叶片卷缩，但引起小构树叶片黄化卷曲的病原未见报道。基于此本研究对小构树的黄化卷曲叶片进行转录组测序分析，对其中的病毒及D-DNA形式进行鉴定分析，为今后该病毒的寄主及防治研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2021年6月至8月在陕西省安康市汉滨区建民镇(JM)、恒口镇(HK)、吉河镇(JH)采集小构树表现黄化卷曲症状叶片(Kozo)各2份，液氮速冻后-86℃保存备用。高保真Taq酶购自宝生物工程(大连)有限公司，其余试剂均为国产或进口分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 转录组测序及病毒序列分析 取3个地点的小构树叶片各1份，采用植物总RNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取RNA，送生工生物工程(上海)有限公司进行文库构建，并采用HiSeq2000平台(美国ABI)进行转录组双末端测序，测序长度150 bp。对测序所得数据进行质控处理，去除序列接头、Q值＜20、长度小于35 bp的序列，得到的clean data用Trinity 2.8进行无参组装，参数设置为min_kmer_cov 2，其余默认。将无参组装获得的所有序列进行在线BLASTx和BLASTn比对分析，利用HISTA 2.2软件比对分析clean data中病原的基因组序列及覆盖度。

1.2.2 PCR检测和克隆测序鉴定 根据组装获得的病毒序列设计引物(表1)。利用植物基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取Kozo-JM、Kozo-HK、Kozo-JH样本的基因组DNA，分别使用750F/2455R、3460F/1780R和2420F/3580R引物组合对3个样本的基因组进行PCR扩增。扩增体系为:2×Premix 25 μL，上下游引物(20 μmol/L)各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O补齐至50 μL。扩增程序为:94℃5 min；94℃30 s，52℃45 s，72℃1 min，30个循环；72℃10 min。琼脂糖凝胶回收试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]回收扩增目的条带，连接至pGEMT easy载体(Promega公司)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞[宝生物工程(大连)有限公司]，挑取3个阳性克隆送生工生物工程(上海)有限公司进行测序。

表1 本研究使用引物及序列

1.2.3 序列分析 克隆子序列的拼接使用Bioedit 7.2.5，使用在线ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)预测编码区，使用FGENESH 2.6[6]预测内含子，蛋白的保守功能域预测使用在线CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi/)[7]和SMART(http://smart.embl.de/)，使 用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测跨膜结构域，使用MUSCLE 3.8.31[8]进行多序列比对。

1.2.4 D-DNA的扩增和分析 根据双生病毒可能存在D-DNA的情况，对1.2.2中的非目标扩增条带产物进行回收和克隆测序。同时再次提取Kozo-JM、Kozo-HK、Kozo-JH样本各1份的基因组DNA，使用2420F引物分别和1780R以及3700R引物对各样本进行PCR扩增，分别回收各扩增条带，挑取3个克隆送生工生物工程(上海)有限公司进行测序，分析其中的D-DNA。

2 结果与分析

2.1 转录组测序

Kozo-JM、Kozo-HB、Kozo-JH样本的转录组测序数据经质控处理，分别获得45 808 556、45 564 724、44 670 450条高质量序列，平均长度分别为140.69、137.70、138.81 bp；Trinity组装所有序列获得77 583条unigene；经BLASTx和BLASTn比对分析，得到一条与PMLCV-2同源的病毒序列，命名为小构树卷叶病毒(Kozo leaf curl virus 2，KozoLCV-2)，未发现其它病原序列。

2.2 病毒序列的PCR扩增和克隆测序

使用设计合成的引物750F和2455R、3460F和1780R以及2420F和3580R对3个小构树样本中的病毒序列进行PCR扩增，结果750F和2455R引物对扩增出1 700 bp左右的单一条带(图1A)，3460F和1780R引物对除了扩增出约2 100 bp的主条带，还在1 300 bp左右有一弱条带(图1B)，2420F和3580R引物对在JM和HK样本中扩增出1 200 bp左右的单一条带，JH样本同时还获得了500 bp左右的2条扩增条带(图1C)。

图1 KozoLCV-2的PCR扩增

对扩增条带1a、1b1和1c1进行回收克隆测序，拼接各序列获得基因组序列，KozoLCV-2-JM和KozoLCV-2-HK长3 756 bp，KozoLCV-2-JH长3 758 bp(GenBank登录号:OL514011～OL514013)，均为环状结构，相互之间相似性在97.46%～99.65%，与PMLCV-2(MN595126～MN595128)序列相似性为88.82%～94.59%。

2.3 KozoLCV-2的D-DNA扩增和克隆测序

对2.2中PCR扩增的条带1b2、1c2和1c3进行克隆测序，以分析其中是否存在D-DNA序列。结果分别获得了1 270、610、582 bp序列，3条序列均发生了部分片段的缺失。

进一步使用2420F和1780R引物进行PCR扩增，结果3个样本均在约1 200 bp和650 bp处分别有2条条带(图2A)；使用引物2420F和3700R进行PCR扩增，Kozo-JM和Kozo-HK样本只有一条约150 bp条带，而Kozo-JH样本在约500 bp处还有两条扩增条带(图2B)。

图2 KozoLCV-2的D-DNAs的PCR扩增

对2a1、2a2、2b1、2b2、2b3扩增条带进行克隆测序，2a1、2a2、2b1和2b2分别获得1 196、635、549 bp和453 bp的序列，2b3的克隆子获得了6条长度从128 bp到153 bp的序列。拼接组装所有序列获得10条长度1 257～3 114 bp的D-DNAs(GenBank登录号:OL581701～OL581703，OL581710～OL581715，OL581717)。

2.4 序列分析

本研究获得的KozoLCV-2基因组结构与PMLCV-2非常相似(图3A)，正义链均含有4个ORF(V1、V2、V3和V4)，互补链2个(C1和C1:C2)；LIR位于C1和V3间，含有复制和转录所需的由高度保守的非核苷酸基序TAATATTAC及其两侧富含GC的反向重复序列形成的茎环结构(图3B)；SIR位于V4和C1:C2间，也是正义链和互补链转录终止区。

进一步分析KozoLCV-2的编码区，V1的ORF与V2部分重叠，其编码的CP蛋白(E值4.41e-24)与PMLCV-2和柑橘褪绿矮缩相关病毒(Citrus chlorotic dwarf associated virus，CCDaV)的CP蛋白相似性分别为98%和73%。V2的ORF长321 bp，编码106个氨基酸，N末端和中心区相对保守。V3区长216 bp，与V2部分重叠，编码71个氨基酸，其中E13～V35为其跨膜结构域。V4区长909 bp，编码302个氨基酸，在线CD预测其N11～S284区域与双生病毒BL1移动蛋白有非常高的相似性(E值7.85e-107)。互补链上的两个ORF(C1和C1:C2)分别编码RepA和Rep，与PMLCV-2和CCDaV的同源蛋白相似性分别为90%和67%，含有双生病毒Rep的相关结构域，如Motif I(F37LTYP41)、Motif II(H79VH81)、RCR motif III(Y131LKKS135)以及Walker A(G246PSRSGKT253)和Walker B(L279YNVIDDI286)等。

另外本研究KozoLCV-2的互补链上存在一个长119 bp的内含子(图3C)，AU(61.34%)含量明显高于两侧外显子。利用转录组clean data分析其对基因组的覆盖度，获得了37条序列覆盖两外显子间的连接处(图3C)，表明其为选择性剪接内含子，为体内同时产生编码RepA和Rep的选择性剪接提供了证据。

分析拼接所得10种D-DNAs形式，其中9种有完好的双生病毒茎环结构，1种形式的该结构被来自PMLCV-2-TL的RepA第二外显子的末端序列(2 531～2 636 bp)的插入破坏，该序列还同时插入了3种D-DNAs的SIR区。7种DDNAs形式有完整的ORF(V1～V4)，完全或部分缺失了复制酶区域，2种D-DNAs形式仅有ORF V4和V1部分(图3D)，仅一种D-DNA有完整ORF V1和V4以及复制酶区域。

图3 KozoLCV-2基因组结构特征及其D-DNAs的结构示意图

3 讨论与结论

小构树广泛分布于我国各省区，富含黄酮、生物碱和高蛋白，具有较大的经济和药用价值，迄今为止，未见有关小构树病原体的研究。本研究应用转录组高通量测序获得了小构树黄化叶片中的双生病毒序列，并通过不同覆盖区域克隆子的测序，证实了小构树的双生病毒序列、环状基因组结构及其D-DNAs形式。

与本研究KozoLCV-2具有序列相似性的病毒还有来自双生病毒Citlodavirus属的CCDaV[9]、PCMoV[10]、CaCDaV[11]，尤其V1(CP)和C1:C2(Rep)区。但KozoLCV-2的V2编码的氨基酸仅与PMLCV-2的V2有高相似性，与CaCDaV的MP(QEQ92297.1)部分区域有50%的相似性。KozoLCV-2的V3编码氨基酸，除PMLCV-2外，没有其他匹配结果，类似的结果也存在于Euphorbia caput-medusae latent virus(EcmLV)[12]、Turnip curly top virus(TCTV)[13]、Eragrostis curvula streak virus(ECSV)[14]等双生病毒中。KozoLCV-2的V4有典型的30 kD运动蛋白家族的特征，且序列上有dsDNA结合需要的Motif I、滚环复制中蛋白质构象和DNA断裂的金属结合位点域Motif II、DNA切割催化位点域motif III[15]以及核苷酸结合位点的重要成分Walker A和Walker B域[16]。

转录组数据中互补链的转录本为KozoLCV-2互补链含有内含子提供了证据，其具有植物U2型内含子(U2-type intron)的分支点特征和剪接位点[17]，AU接近高效拼接所需的最小值[18]，表明KozoLCV-2的Rep蛋白表达可能类似玉米条纹病毒Maize streak virus(MSV)[19]、Beet curly top Iran virus(BCTIV)[20]以及Grapevine red blotch-associated virus(GRBaV)[21]和EcmLV[12]等。

双生病毒的D-DNA可以通过病毒基因组的缺失、倒置、重复、重排及外源DNA的插入形成，为病毒的重组提供了原始材料，丰富了双生病毒种群多样性[22]。D-DNA还能干扰辅助病毒的复制，如非洲木薯花叶病毒[African cassava mosaic virus(ACMV)]的DNA-B缺陷分子和胜红蓟黄脉病毒[Ageratum yellow mosaic virus(AYVV)]的DNA-A缺陷分子[4]，与辅助病毒的基因组DNA共同竞争寄主细胞资源，使病毒诱导的典型病症减轻。由于缺陷DNA独特的抗病毒作用，已被作为疫苗佐剂应用于动物病毒防治[23]。

本研究发现，虽然KozoLCV-2和PMLCV-2基因组结构和组成非常相似，但小构树的KozoLCV-2基因组同时存在D-DNAs，而Qiu等[5]的研究以及本团队检测患病构树中均没有D-DNA分子(结果未展示，GenBank登录号:OL514014～OL514016)，说明同种病毒的D-DNA的产生具有宿主差异性。