轮作对贵州烤烟农艺和经济性状及真菌群落结构的影响

张邦喜，顾小凤，张萌，魏全全，柳玲玲，芶久兰

(贵州省农业科学院土壤肥料研究所，贵州 贵阳 550006)

贵州是我国第二大烤烟种植省份，烟叶生产在其经济发展中占有重要地位[1]。近年来由于贵州烤烟产业的快速发展，导致烤烟连作现象突出。连作可使烟草生长发育受阻，生长势变弱，烟株抵御病虫能力、产量和品质下降，并具有累加效应[2]。研究发现，连作导致烤烟有效叶片数、叶面积指数和产量等指标呈下降趋势[3]。烤烟轮作不仅可以有效改善其农艺性状，提高植株根系活力，还具有增产作用，提升经济指标和改善感官质量[4，5]。王丽萍等[6]研究发现，皖南烟区采取烟稻的轮作模式，能够有效降低烟叶田间发病率，提升烟叶产量和质量，增加烟农种烟效益。研究证明，烟叶生长各时期，轮作模式下烤烟的农艺性状均优于不轮作处理，同时对土传病害黑胫病有明显的抑制效果[7]。

土壤中真菌含量状况是评价土壤肥力变化的重要指标之一，对土壤养分含量和作物根系的活力具有较大影响，在保持土壤生态系统平衡以及土壤质量方面具有重要作用[8]。连作对根际土壤真菌群落有较大影响[9]:如蕨麻连作4年后的土壤真菌丰度很高[10]；连作导致土壤细菌与真菌数量的比值降低，土壤微生物群落结构由“细菌型”转变为“真菌型”[11]；连作后根际土壤中自毒物质不断积累，真菌群落结构发生改变，链格孢霉、镰刀菌等有害真菌富集[12]；大豆连作增加了潜在致病真菌尖孢镰刀菌数量[13]。研究证明轮作影响植物残体的数量和质量，植物残体是微生物的营养来源，可导致土壤微生物的功能发生变化[14]。轮作系统下土壤真菌OTU数、多样性、均匀度指数等均高于连作系统[15-17]。如水稻-大豆轮作系统显著提高了土壤中丛枝菌根真菌孢子的出现频率[18]；引入豆科作物的轮作模式显著改变了AM真菌多样性及群落组成[19]；随着蔬菜-牧草轮作系统中草地生长年限的增加，土壤微生物群落结构发生显著改变，且趋近于永久性草地土壤微生物群落结构[20]；轮作后花生根表有益微生物比例明显高于连作[21]；轮作烟田根际土壤中拮抗菌的相对丰度均高于连作烟田，而连作烟田根腐病病菌腐霉属的丰度较高[22]。同时有研究发现，轮作与施用有机肥相结合，可以最大程度地降低真菌与细菌的比例[23]。

绿肥作为高效清洁的有机肥源，与主作物合理搭配，可有效降低主作物土传病害的发生和危害。绿肥种植后翻压或施加外源绿肥对土传真菌病害具有良好的抑制作用。绿肥在种植过程中可活化土壤中的难吸收养分，且在腐解过程中释放速效养分，保证了作物的养分供给，提高了作物的整体健康水平。绿肥部分化合物的水解产物具有直接灭杀或抑制土壤病原物的能力。翻压或施加绿肥可显著提高土壤微生物种群数量，与病原菌形成竞争或拮抗效应[24]。大量研究发现，深耕或绿肥掩青条件下可增加烤烟株高、有效叶片数、茎围和叶面积等农艺性状指标，提高烤烟产量、产值和上等烟比例，改善烤烟化学成分的协调性，减轻根腐病和黑胫病的发生[25-27]。目前针对贵州烤烟轮作研究相对较少，因此，本研究通过大田试验，定性分析轮作对烤烟农艺、经济性状及真菌群落结构的影响，以期为贵州烤烟的合理高效种植提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验地概况及材料

本试验于2018年10月—2020年8月在贵州省毕节市黔西县永燊彝族苗族乡(106°11′41″E，27°7′34″N)进行，平均海拔1 205 m。供试土壤为贵州典型石灰岩发育的黄壤，基本理化性质如下:pH值5.92，有机质18.59 g/kg、全氮1.31 g/kg、有效磷16.60 mg/kg、速效钾232.00 mg/kg。供试烤烟品种为毕纳1号，由毕节市烟草公司黔西县分公司提供。供试有机肥为酒糟有机肥(N+P2O5+K2O＝6.2%)，供试化肥为烤烟专用基肥(N∶P2O5∶K2O＝10∶15∶24)、烤烟提苗肥(N∶P2O5∶K2O＝15∶8∶7)和烤烟专用追肥(N∶P2O5∶K2O＝13∶0∶26)，均由毕节市烟草公司黔西县分公司提供。绿肥为66-25箭筈豌豆，由毕节市黔西县土肥站提供。

1.2 试验设计

试验采取随机区组设计，共4个处理:烤烟连作(T)；白菜-烤烟轮作(C-T)；豌豆-烤烟轮作(P-T)；绿肥-烤烟轮作(GM-T)。小区面积为42 m2，小区间设置0.5 m隔离带，每处理3次重复。烤烟行距1.05 m，株距0.57 m，种植密度16 500株/hm2。各小区管理方式一致。在施肥过程中，根据等量养分原则，T和C-T处理施肥一致，因P-T处理直接将豌豆翻压于土壤中，GM-T处理直接将绿肥翻压于土壤中，故P-T和GM-T处理的专用基肥和追肥需减量。豌豆和绿肥的养分含量及水分含量如表1所示，计算后将P-T和GM-T处理的专用基肥和追肥分别减少80 kg/hm2和110 kg/hm2。各处理具体施肥量如表2所示。

表1 豌豆和绿肥的养分含量

表2 不同处理的肥料施用量

1.3 样品的采集与测定

1.3.1 土壤样品的采集 于2020年8月烤烟采收结束后，在每个小区采用“S”形取样法设置15个采样点，每个采样点采集0～20 cm土壤样品。剔除枯枝落叶、碎石等杂物后把土壤样品混匀用锡箔纸包裹，迅速装入离心管，液氮冷冻条件下运输，之后转移至-80℃冰箱保存，用于土壤微生物高通量测序分析。

1.3.2 土壤DNA提取和16S rRNA基因高通量测序 每个样品称取0.5 g新鲜土壤，采用FastDNAⒸSPIN Kit for Soil(MPBiomedicals)试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]提取土壤微生物总DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品是否降解以及有无杂质，使用Nanodrop 2000分光光度计[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]检测样品纯度。经DNA浓度和纯度检测后(DNA浓度≥20 ng/μL，总量≥500 ng，D260/280为1.8～2.0)，利用ABI GeneAmpR 9700型PCR仪[美国应用生物系统公司(ABI)]进行PCR扩增，扩增引物为338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTAHVGGGTWTCTAAT-3′)。PCR反应体系:5×TransStart FastPfu缓冲液4 μL，2.5 mol/L dNTPs 2 μL，上下游引物(5μmol/L)各0.8 μL，TransStart FastPfuDNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O补足至20 μL。每个样品3个重复，采用2%琼脂凝胶电泳检测PCR扩增效果。利用Thermo Scientific公司的GeneJET胶回收试剂盒回收目标条带，测序服务委托上海美吉生物医药科技有限公司完成。

1.3.3 植株样品的采集 在烤烟收获期，各小区选取有代表性植株6株，用尼龙袋装好，于实验室进行农艺性状的测定。

1.3.4 根、茎、叶农艺指标的测定 分别测量6株烟株的叶长、叶宽、茎高、茎围、根干重、茎干重、叶干重、有效叶片数。选取烟株自上而下第5、10、15片叶处测定茎围，取平均值。选取烟株自上而下第10片叶测量叶长、叶宽，取平均值。将烟株进行烘烤，测定根、茎、叶干重，取平均值。

1.3.5 产值的测算 各处理实采实收，分别计产。烤烟分期采收烘烤，各个时期实际采收烘烤量相加即为小区的实际产量。通过面积换算得到产值。

1.4 统计与分析

利用SPSS 20.0进行方差分析(P＜0.05)，采用Origin 8.0软件进行作图。图表中数据为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 轮作对烤烟农艺和经济性状的影响

如表3所示，轮作后，烤烟的叶长、叶宽、茎高和茎围受到一定影响，但差异不显著。与T处理相比，轮作使叶长增加1.00～3.33 cm、叶宽增加1.00～1.66 cm、茎高增加6.67～14.17 cm、茎围增加0.34～0.84 cm，均以GM-T处理增加幅度最大。

表3 种植模式对烤烟农艺性状的影响 (cm)

如表4所示，轮作对烤烟的根干重、茎干重、叶干重、有效叶片数、产值等指标产生一定的影响。与T处理相比，轮作使根干重、茎干重、叶干重分别增长21.10%～53.99%、11.66%～16.42%、27.54%～36.36%，其中GM-T处理与T处理间上述指标均达到差异显著水平。与T处理相比，轮作使烤烟有效叶片数增加7.75%～11.65%，GM-T处理增幅最大。轮作后，烤烟的产值有所提升，其中C-T处理增加2 960.14元/hm2、P-T处理增加6 902.36元/hm2、GM-T处 理 增 加6 104.46元/hm2，P-T和GM-T处理与T处理间达到差异显著水平。

表4 种植模式对烤烟经济性状的影响

2.2 轮作对土壤真菌OTU数的影响

由图1可知，共得到1 840个OTU，其中T、C-T、P-T、GM-T处理OTU数分别为628、694、653、790个。4个处理的共同OTU数为142个，分别占T、C-T、P-T、GM-T处理总OTU数的22.61%、20.46%、21.75%和17.97%。T、C-T、PT、GM-T处理各自特有的OTU数分别为293、331、293、405，占相应处理总OTU数的46.66%、47.69%、44.87%和51.27%。由此可见，轮作增加了土壤中真菌的OTU数，其中GM-T处理增加幅度最大，为25.80%，且GM-T处理特有的OTU数最多。

图1 种植模式对土壤真菌OTU数的影响

2.3 轮作对土壤真菌群落丰度和多样性的影响

2.3.1 轮作对土壤真菌门水平群落结构的影响通过对不同处理下土壤真菌门水平群落组成分析发现，在门水平上共检测出13个真菌种类和未确定类群，T、C-T、P-T、GM-T处理分别有10、12、11、12个门。其中，子囊菌门(Ascomycota)、球囊菌门(Mortierellomycota)、担子菌门(Basidiomycota)的相对丰度较高，分别为60.64%～72.65%、4.65%～21.12%、3.75%～7.57%(图2)。进一步分析发现，烤烟轮作模式并未改变土壤中真菌的种类，但改变了优势菌的丰度。轮作使得前6种优势菌的丰度之和下降，说明烤烟轮作在一定程度上改变了土壤中的真菌群落多样性。其中，PT和GM-T处理的子囊菌门(Ascomycota)丰度较T处理下降了3.15%和15.98%，子囊菌易引起根腐、茎腐、果(穗)腐和枝枯等，说明轮作可以减少土壤中的病原菌，改善土壤微环境，从而减轻作物病虫害。

图2 种植模式对土壤真菌门水平群落结构的影响

2.3.2 轮作对土壤真菌属水平群落结构的影响在属水平上共检测出290个真菌种类和未确定类群，T、C-T、P-T、GM-T处理分别有167、171、173、178个属。其中，镰刀菌属(Fusarium)、被孢霉菌属(Mortierella)、曲霉菌属(Aspergillus)、青霉菌属(Penicillium)、茎点霉属(Setophoma)的相对丰度较高，分别为11.80%～24.23%、4.65%～21.12%、2.57%～21.18%、1.58%～11.45%、2.79%～6.13%(图3)。进一步分析发现，烤烟轮作并未改变土壤中真菌属的种类，但改变了其优势菌属的丰度，轮作后土壤中的前11种优势菌属的丰度之和下降。轮作降低了土壤中的曲霉菌属(Aspergillus)和青霉菌属(Penicillium)的丰度，其中，在GM-T处理中，曲霉菌属(Aspergillus)的丰度下降幅度最大，为87.87%；P-T处理的青霉菌属(Penicillium)下降幅度最大，为86.20%。此外，与T处理相比，GM-T处理的镰刀菌属(Fusarium)丰度显著增加94.62%，被孢霉菌属(Mortierella)丰度显著增加354.19%。

图3 种植模式对土壤真菌属水平群落结构的影响

2.3.3 轮作对土壤真菌群落结构影响的LefSe分析 通过对不同种植模式下的土壤微生物群落进行LefSe分析(图4)发现，在C-T和GM-T处理间存在对土壤有重要作用的真菌种类。C-T处理有Coniochaetales、Coniochaetaceae、腐质霉属(Humicola)、被毛枝葡萄孢属(Botryotrichum)、毛壳菌科(Chaetomiaceae)；GM-T处理有毛壳属(Chaetomium)。

图4 种植模式对土壤真菌群落结构影响的LefSe分析

3 讨论

3.1 轮作对烤烟农艺及经济性状的影响

不同种植模式对烟叶的产量和产值均有影响。烤烟连续单作，自毒物质富集，病原微生物增加，进而引起连作障碍，导致烟草产量降低，品质变劣。随着连作年限的增加，烟草长势变弱，烤烟的产量和产值均有所下降[28，29]。轮作是克服烟草连作障碍的有效措施之一，是提高烟叶产量和质量、降低病虫害的有效途径[30]。阳显斌等[31]发现烟蒜轮作后烟叶产量较单作提高了35.04%。在烤烟轮作中，翻压豆科绿肥能改善烤烟农艺性状，提高烤烟产量，增加产值。特别是翻压箭舌豌豆，不仅能增加株高、茎围、节距、最大叶长和叶宽，还能提高烤烟根系覆盖范围和增加主、侧根重量[32]。在本试验中，轮作后，烤烟的叶长、叶宽、茎高和茎围均较连作增加；根干重、茎干重、叶干重也较连作处理增加，且GM-T处理与T处理间差异显著；同时轮作还提高了烤烟的产值，P-T和GM-T处理与T处理间差异显著。研究结果与前人一致，这是因为烤烟轮作的种植方式具有较强的物质生产能力，可以提高烤烟产量[33]。本试验中GM-T处理提升烤烟农艺性状和产量效果最佳，这是因为绿肥生长发育过程中的根系穿插、根系分泌和根毛细胞脱落可增强土壤微生物活性，起到调节土壤养分平衡、降低土壤容重、消除土壤不良成分的功效。同时绿肥还能促进植烟土壤难溶性养分的转化，有利烟草吸收利用。翻压绿肥后，可大量增加植烟土壤中有机质、氮、磷、钾和各种微量元素含量，能协调植烟土壤碳和氮的平衡从而调节土壤生物活性和养分循环[34]。同时，翻压绿肥能提高烤烟根系覆盖范围和增加主、侧根重量，从而提高烤烟产量[32]。

3.2 轮作对烤烟真菌群落多样性的影响

土壤真菌参与关键的生态过程，包含大量土传病害的致病因子及拮抗因子。细菌性土壤是土壤质量良好的一个重要指标，而真菌性土壤则代表着土壤贫瘠，病虫害加重[35]。长期连作会导致土壤真菌菌群结构发生变化，对土壤真菌群落的功能多样性有影响，致病菌增多，且随着连作年限的增加影响越大[9]。轮作改善了土壤生态环境，使之适合多种真菌的繁殖生长，多种真菌共同存在，互相制约，可防止某些病原真菌过度繁殖，抑制作物病害的发生[36]。在轮作土壤中，真菌种群丰富；在连作土壤中，真菌优势种群突出，20种优势菌株的丰度之和显著超过轮作[13，36]。本试验中轮作使得真菌门水平上前6种优势菌种和属水平上前11种优势菌属的丰度之和较T处理均下降。说明烟草轮作在一定程度上减缓了土壤微生物结构从细菌型向真菌型的转化。这是因为轮作(尤其是绿肥轮作)能够使根瘤固氮，增加了土壤中的氮素，为细菌型微生物的生长提供了足够的碳源和氮源；同时，绿肥腐解过程需要大量微生物的参与，从而促进了土壤微生物的繁殖，使土壤微生物活性增强和数量増加。

子囊菌可引起根腐、茎腐、果(穗)腐和枝枯等病害[37]。轮作后，P-T和GM-T处理的子囊菌门(Ascomycota)相对丰度较T处理下降了3.15%和15.98%。曲霉(Aspergillus)在土壤中比较常见，一般不侵染烟草[38]。但也有研究发现，曲霉(Aspergillus)和青霉(Penicillium)属真菌会导致烟叶霉变[39，40]。本试验轮作处理土壤中的曲霉菌属和青霉菌属的丰度较T处理降低，可能因为轮作改善烤烟生长环境，使病原菌减少，从而改善了烟叶品质。被孢霉科是土壤有机质和养分含量丰富的标志，其能分解土壤中的糖类和简单多糖物质。被孢霉属是被孢霉科中的一个大属，具有溶解土壤中的磷、分解纤维素、半纤维素及木质素能力，能利用土壤中的糖类物质进行生长代谢，增加土壤有机质和养分含量[41]。被孢霉属真菌能分解有机物质，促进植物根系吸收矿质元素，此外它还具有潜在分泌抗菌素的能力，抑制病原菌[42，43]。在本试验中，轮作处理的被孢霉菌属的丰度有所提高，其中GM-T处理的提升幅度最大，P-T处理次之。这是因为绿肥在翻压腐解过程中，改善了烤烟根际土壤养分，有利于被孢霉生长繁殖。一部分研究认为镰刀菌属真菌是一种常见的烟草病原微生物，某些镰刀属真菌伤害烟草的根系和维管束组织，从而引发烟草根腐[44]。但吴元华等[45]在生防镰刀菌(Fusariumsp.)对烟草列当的防效研究中发现，镰刀菌属(Fusarium)对烟株的抗病能力有较明显作用，在穴施生防镰刀菌后，烟田其他病害的发病率和病情指数有所降低，烟叶产量和品质提高。本试验中，轮作土壤中的镰刀菌属(Fusarium)丰度较T处理有所提高，这可能是因为轮作后，烤烟土壤环境改变，导致了土壤中镰刀菌属的繁殖。但此种镰刀菌属对烤烟生长影响如何，仍需进一步试验研究。

4 结论

本研究结果表明，烤烟轮作提升了烤烟农艺性状和产量。轮作后，真菌门水平和属水平上的优势菌属的丰度之和较连作均下降，在一定程度上减缓了土壤微生物结构从细菌型向真菌型的转化。轮作降低了病原型真菌(子囊菌、曲霉菌和青霉菌)的相对丰度，提高了有益真菌被孢霉菌的相对丰度，以GM-T处理效果最佳。因此，在贵州进行烤烟轮作，特别是绿肥-烤烟轮作能增加烤烟收益，减少土壤中的病原菌，增加土壤有益微生物菌群，减缓连作障碍，为烤烟良好循环种植提供基础。